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潜隐性双链RNA病毒Raphanus sativus virus1(RasV1)由本实验室陈亮等在一点红萝卜中发现。当时认为该病毒含两条dsRNA(RasR1和RasR2),序列分析显示RasR1与RasR2分别编码RasV1的RdRp和CP,并表明RasV1很可能为双分病毒科成员。之后李露露等在同种萝卜中发现一条新的dsRNA(RasR6),序列分析表明RasR6与RasR1和RasR2的5UTR序列高度同源,且其3末端具有poly A结构,RasR6可能编码双分病毒科成员CP。由此推测RasR6与RasR1、RasR2同属于RasV1。但由此产生了该病毒组成与传统的双分病毒科病毒组成相悖的问题。
为了通过实验确认萝卜潜隐性dsRNA病毒Raphanus sativus virus1(RasV1)的基因组构成并为dsRNA病毒侵染性克隆的深入研究提供基础,本文开展了RasV1基因组多片段共表达载体构建及拟南芥转化的研究。(1)对RasR1进行重新克隆。对保存的RasV1基因组3条dsRNA的cDNA克隆质粒进行DNA测序,发现RasR2和RasR6的cDNA序列与Genebank登录序列一致,但RasR1的eDNA序列有部分碱基缺失,序列正确的质粒因故丢失,因此对RasR1采用RT-PCR方法从一点红萝卜中重新克隆,经酶切鉴定、PCR鉴定及DNA测序确认为正确序列。(2)RasV1基因组多片段共表达载体的构建。采用多位点Gateway克隆方法,通过BP反应分别构建入门克隆pDG3R1、pDG3R2和pDG3R6,然后将三个入门克隆与双元表达载体pK7WG2D.1混合,通过LR反应构建目的克隆,即共表达载体pKR1R2R6,经酶切鉴定、PCR鉴定及DNA测序确认正确。(3)RasV1基因组多片段共表达载体转化拟南芥。将共表达载体转化农杆菌GV3101感受态细胞。利用农杆菌侵染野生型拟南芥的花序,从而将共表达载体整合到拟南芥基因组中。(4)转基因拟南芥的筛选及鉴定。将子一代转基因拟南芥播种于含卡那霉素的种子萌发MS固体培养基,初步筛选出具有卡那霉素抗性的植株。在荧光倒置显微镜下观察具有卡那霉素抗性植株的叶片中的GFP绿色荧光,进一步筛选阳性植株。利用基因组DNA-PCR、基因组DNA斑点杂交、RT-PCR等分子生物学手段鉴定阳性植株,表明阳性植株存在目的基因RasR1、RasR2和RasR6。上述结果证实萝卜潜隐性病毒RasV1全基因组的3条基因序列已成功转化入拟南芥基因组中。然而,在转基因拟南芥中并未提取到病毒的dsRNA,原因有待进一步研究分析。