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目的:利用噬菌体展示肽库技术制备并筛选出ABCG2特异性全人源肺腺癌噬菌体单链抗体,验证其免疫学活性、增值抑制和顺铂增敏作用,放射性核素标记抗体后进一步行裸鼠体内放免显像研究,为临床肺腺癌的化疗耐药逆转和分子靶向治疗提供理论和实验依据。方法与结果:第一部分单链抗体库的构建1.ScFv基因的合成:以肺腺癌患者癌旁阳性淋巴结为组织来源,提组织总RNA。逆转录合成cDNA,PCR扩增VH和VL基因片段。以VH和VL为模板继续PCR,分别在其上下游加上Linker序列。等摩尔量的VH-Linker-和Linker+-VL片段经SOE-PCR拼接成scFv片段。1%琼脂糖凝胶电泳验证RCR产物大小并切胶回收各产物片段。结果显示:提取的组织总RNA纯度较好无降解,A260/A280比值达1.98;VH、VL、VH-Linker-、Linker+-VL及scFv产物大小分别为360 bp、340 bp、410 bp、390 bp和750 bp,大小与预期相符。2.初级抗体库的制备:纯化的scFv片段经Sfi I和Not I双酶切后到与噬菌体表达载体pcantab5e连接。连接产物电转化至感受态大肠杆菌tg1。质粒pcr结果显示scfv片段阳性插入率达100%(12/12),双酶切鉴定正确,阳性质粒行测序验证,序列比对结果与整码的scfv编码序列一致性可达99%。3.噬菌体抗体的表达:2×yt培养液收集含阳性质粒的平板,利用m13ko7辅助噬菌体感染诱导scfv片段的融合表达。第二部分单链抗体的筛选、纯化及免疫活性检测1.a549肺腺癌细胞和abcg2纯化抗原对抗体库的联合筛选:以a549细胞先对初级抗体库进行3轮“吸附-洗脱-扩增”的全细胞筛选,再用abcg2抗原进行3轮固相筛选。经过6轮筛选,抗体库效价由首轮1.54×10-6逐轮提升至1.7×10-4,滴度提升约110倍。2.单链抗体scfv的可溶性表达和免疫活性鉴定:将噬菌体elisa验证呈阳性的噬菌体抗体感染e.colihb2151,iptg诱导scfv可溶性表达。经hitraptmanti-etag亲和层析柱纯化后行sds-page电泳鉴定,同时以抗e-tag抗体为一抗(1:3,000)行western-blot检测,结果显示在34kda处有一条清晰的条带。以非靶向scfv为对照,elisa和免疫细胞化学检测scfv的特异性发现该scfv与肺腺癌a549细胞的结合具有相对特异性。竞争elisa结果显示,当抗体1:500稀释时,scfv对igg的结合抑制率为4.56%±1.96%;1:1稀释时,结合抑制率增加到68.09%±4.27%,表明该scfv对a549细胞具有较高的亲和力。第三部分单链抗体的增殖抑制及化疗增敏实验1.cck-8、克隆形成、迁移实验及流式细胞术:单链抗体scfv处理a549细胞48h后进行cck-8增殖实验分析发现scfv对细胞增殖呈时间依赖性抑制。克隆和迁移实验表明scfv能够明显抑制a549细胞的集落形成和穿膜能力。凋亡和周期结果显示,scfv诱导a549细胞凋亡率明显增加(47.95%±5.43%vs.9.21%±2.38%,p<0.01),且细胞周期阻滞于g1期(70.70%±1.81%vs.52.44%±2.72%,p<0.01)。2.单链抗体对肺腺癌细胞的化疗增敏作用:a549细胞经scfv处理后对顺铂的敏感性明显增加,ic50值(5.31±0.49μg/mlvs.0.06±0.03μg/ml)随scfv剂量增加而减小。3.单链抗体调节耐药蛋白表达:a549细胞经不同剂量scfv处理后,提取细胞总蛋白,行westernblot检测。结果表明scfv能够明显下调abcg2蛋白表达,且对abc家族的其他成员mdr1也有一定的协同抑制作用。第四部分单链抗体的放免显像研究采用氯胺t法对单链抗体scfv进行放射性核素131i的标记。标记后的scfv经尾静脉注射至荷人肺腺癌裸鼠体内,测定不同时间点裸鼠体内肿瘤及其他各组织%id/g(每克组织百分注射剂量率),并行spect/ct显像。结果显示:注射131i-scfv后,裸鼠体内各组织对抗体的摄取量逐渐增加,以肿瘤组织最明显,相应的瘤/血、瘤/肌肉、瘤/脑的放射性比值呈逐渐升高趋势并在第24h达到峰值(3.45±1.06、4.51±0.89和23.65±3.00),随后逐渐降低。spect/ct融合显像发现肿瘤部位具有相对特异性的放射性聚集,以第24h显像最清楚。第五部分单链抗体的体内抗肿瘤活性检测新鲜分离的A549细胞(2×106/100μL PBS)皮下注射至裸鼠背部,当肿瘤生长至约500 mm3左右时,将裸鼠随机分为四组:生理盐水NS组、单抗scFv组、顺铂DDP组和scFv+DDP联合组(scFv 10 mg/kg,i.p.,d1-3 and DDP 2.5 mg/kg,i.p.,d 4,7.),观察两组肿瘤体积变化情况。收集肿瘤组织,石蜡包埋切片,以Ki-67和cleaved caspase 3抗体行免疫组化染色以检测增殖和凋亡。结果显示scFv+DDP联合组瘤体明显小于对照组且具有明显增加的cleaved caspase 3和降低的Ki-67表达。结论:本研究以噬菌体展示肽库技术为基础,制备并筛选出ABCG2特异性全人源肺腺癌噬菌体单链抗体,检测抗体的免疫活性、化疗增敏和体内外增殖抑制作用,并经放射性核素标记后进一步行体内分布研究及放免显像研究。结果表明成功筛选出ABCG2特异性人肺腺癌单链抗体,具有较高亲和力和特异性,能够有效抑制肺腺癌细胞增殖,促进细胞凋亡并增加顺铂敏感性。经放射性核素标记的单链抗体显示出良好的动力学特征,对靶组织的亲和力高,具有较满意的放免显像效果,能够为今后深入研究肺腺癌的放免诊断、靶向治疗提供实验基础。