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长时程增强(LTP)是中枢神经系统的一个普遍现象。在海马,LTP被认为是学习记忆的细胞机制。外周伤害性刺激在脊髓背角神经元也可诱发类似海马LTP的可塑性变化,可能是疼痛传导通路中中枢敏化的一个基础,中枢敏化放大了伤害性信息的传入从而产生了痛觉过敏。近年来的研究表明,Ryanodine敏感的胞内钙库及其介导的信号转导途径参与神经元突触可塑性变化。我们前期的工作表明,Ryanodine受体(RyR)参与调控在体脊髓背角伤害性反应的长时程突触可塑性变化。但是,进一步的机制分析需要在离体脊髓切片上进行。
本研究采用离体脊髓切片场电位和全细胞膜片钳记录、分离DRG细胞的全细胞膜片钳记录和钙成像、免疫组化、电镜和行为学的方法,集中研究RyR在脊髓背角的分布及其与脊髓LTP诱导和维持的关系。主要结果如下:
1.建立带背根的脊髓切片全细胞膜片钳和场电位记录技术
制作脊髓切片选用的是2-3周的幼年SD大鼠。切片的制备有横切和纵切两种方法:横切法脊髓切片厚度为.500μM,每片留一个背根,长度为0.8-1.2cm;纵切法脊髓切片厚度为300μM,每片可以留一至三个背根,长度0.8-1.2cm。幼年大鼠脊髓切片全细胞膜片钳和场电位记录稳定。
2.LT刺激在离体脊髓切片上可以稳定地诱导出长时程的突触可塑性
从李骚氏束(Lissauerstract,LT)给高频刺激(High frequency stimulation,HFS)诱导LTP,比从背根(Dorsal root,DR)诱导更稳定。在10μM bicuculline methiodide和1μM strychnine预处理灌流液的情况下,双极刺激电极从LT给予C强度(0.1ms,2-2.5mA)的电刺激,在脊髓背角的浅层可以稳定地记录到场电位的FEPSP,条件刺激HFS(100Hz,1s,间隔10s,给3次)稳定地诱导出TP。
3.Ryanodine受体参与脊髓LTP的诱导,IP3受体不参与
3.1RyRs参与离体脊髓LTP的诱导,但不参与其维持
在HFS前1小时,分别灌流给予RyR的拈抗剂,高浓度的ryanodine(20μM)和dantrolene(10μM),均可阻断脊髓LTP的诱导。建立LTP后30分钟再给dantrolene(10μM),已形成的LTP未受到明显的影响。以上两个拮抗剂对基础反应都没有明显的影响。这和我们之前在整体电生理上所取得的结果基本一致,即:RyRs只参与LTP的诱导,不参与其维持。
3.2RyRs是NO的下游靶点
NO合成酶抑制剂L-NAME(50μM)能够抑制脊髓LTP的诱导,Ryg的内源性激动剂cADPR(5μM)翻转了L-NAME的抑制效应。RyR可能是NO下游的一个重要靶点。
3.3激活Ryas抑制小直径DRG神经元上的BK电流
BK是大电导钙激活的钾通道。在急性打散的小直径DRG神经元上,全细胞膜片钳记录BK电流。RyRs的激动剂10mM的Caffeine使BK电流明显减小。提示:激活的RyRs通过减小Bkca电流进而使DRG神经元的兴奋性增高。
3.4IP3受体既不参与离体脊髓LTP的诱导,也不参与其维持
IP3R是胞内钙的另外一个重要来源。IP3R在脊髓散在分布,但是IP3R的拮抗剂2-APB(75μM)既不影响脊髓的诱导,也不影响其维持。
在海马脑片所做的对照实验显示,2-APB能够阻断海马LTP的诱导,说明2-APB对于脊髓LTP的阴性作用不是由于拮抗剂本身的低效能所造成的,从而进一步证明了IP3R既不影响脊髓的诱导,也不影响其维持。
4.RyRs主要表达在脊髓背角浅层和DRG神经元
神经系统中的Ryg有三种亚型,分别为:Ryg1,RyR2,RyR3;IP3R也有三种亚型,依次是:IP3R1,IP3R2,IP3R3。免疫组化实验观察到,RyR1和RyR3分别存在于脊髓背角Ⅱinner和J层,并在脊髓和DRG分别与C纤维标记物IB4(非肽类)和CGRP(肽类)共标。以上结果提示:在脊髓背角浅层,RyR1和RyR3位于初级传入C纤维的末梢上。脊神经切断术后,同侧脊髓背角RyR1和RyR3的表达明显下调。电镜的结果支持这一结论。在脊髓,没有发现RyR2的分布。
免疫双标实验显示,在脊髓背角RyR1和RyR3与神经元标记物NeuN、MAP2及胶质细胞标记物GFAP、OX42均不共标,也未见RyR1-,RyR2-和RyR3-免疫反应阳性的神经元胞体。以上结果证明,RyR1和RyR3不表达在突触后。
5.激活RyRs对于兴奋性突触传递的影响及CAFLTP
10mM的caffeine使eEPSC和fEPSP的时程大大延长,幅度明显增加。在10μM bicuculline和1μM strychnine预处理的情况下,短暂灌流10mM的caffeine(2min),洗脱后反而诱导出了长时程的增强,这种增强在caffeine洗脱30min以后最明显。增强一直持续到80min以后。
6.激活RyRs突触前递质释放增加
6.1 Caffeine增大mEPSC的频率
采用带背根的脊髓切片全细胞膜片钳方法,记录背根刺激可以诱导出单突触C反应的脊髓背角Ⅱ层神经元的mEPSC。灌流给予10mM的caffeine(灌流液中加入0.5μM的TTX),显著增大了mEPSC的频率,提示:激动RyRs可以使突触前递质释放明显增多。
6.2钙成像:激活RyRs增强DRG神经元[Ca2+]I
正常的DRG外液中,细胞旁压力喷射的方法给予RyRs的激动剂10mM的Caffeine或2μM的ryanodine均引起了[Ca2+]I的瞬时增高。在RyRs的拮抗剂预处理外液的情况下,两种激动剂都不再能引起[Ca2+]I的增高。所以RyR的激活引起[Ca2+]I的升高。
7.行为学实验:拮抗RyRs减小强直刺激所诱导的机械痛
以vonFrey毛刺激所引起的成年大鼠缩腿反射阈值(PWT)作为痛感觉的指标。强直刺激大鼠坐骨神经,在术后的7天里,都可以观察到PWT的降低,亦即出现了触诱发痛。在强直刺激坐骨神经之前40min,鞘内给予RyR拮抗剂dantrolene,可以抑制以致完全阻断PWT的降低。本实验从功能上验证了RyR参与脊髓中枢敏化。
本研究首次为RyR1和RyR3在脊髓背角浅层初级传入C纤维末梢上的表达,提供了包括免疫组化、电镜和电牛理结合药理学的证据,同时首次证明了突触前的ryanodine受体参与脊髓背角伤害性传入诱导的长时程突触可塑性,前者是后者的充分且必要条件。
对于突触前的ryanodine受体参与脊髓长时程突触可塑性的机制,至少还有一下几个问题有待于进一步阐明:
(1)在强直刺激诱导LTP的过程中,ryanodine受体是否由NO激活?
(2)NO是否通过NO-cGMP-PKG信号通路激活ryanodine受体?
(3)RyRs在被激活的过程中是否发生了磷酸化?如果是,哪个位点被磷酸化?
(4)Ryanodine受体通道开放以后,究竟如何促进递质释放?
(5)RyR1与RyR3,哪一个受体亚型参与了脊髓LTP?还是两个都参与?
本工作有望为慢性痛的新药研发和临床治疗提供一个新的靶点。