论文部分内容阅读
背景与目的:癌症是全世界面临的主要公共卫生问题,造成了巨大负担。尽管癌症预防与治疗取得了一定进展,但预计在2030年全球每年新增癌症病例将达到2220万,而癌症导致的死亡人数将达到1310万。其中,甲状腺癌作为内分泌系统的恶性肿瘤,其发病率不断上升,已经引起全球的重视。甲状腺癌是最常见的内分泌系统恶性肿瘤,主要包括四种病理类型:乳头状甲状腺癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)、滤泡状甲状腺癌(follicular thyroid carcinoma,FTC)、未分化型甲状腺癌(anaplastic thyroid carcinoma,ATC)以及髓样甲状腺癌(medullary thyroid carcinoma,MTC)。目前,甲状腺癌的发病原因尚不清楚,医学界仍在积极探索中。虽然临床上大多数甲状腺癌患者具有良好的预后,但仍需要全身摄入药物。甲状腺手术常引起的相关并发症,给患者的生活质量带来严重影响;继发性恶性肿瘤风险的增加和癌症复发的诊断也给患者造成沉重的经济和心理负担。此外,未分化型甲状腺癌(ATC)是最具侵袭性的甲状腺癌,其发病率虽然仅占所有甲状腺癌的2%,但死亡率却占到了50%,其治疗还没有有效方案。因此,寻找降低甲状腺癌发病率的化学预防剂以及新的抗未分化甲状腺癌的化疗药物具有重要意义。白藜芦醇被称为多酚类植物化合物,对癌症的多个阶段均具有抑制作用,而且对正常组织细胞无毒副作用,是一个理想的化学预防剂和抗癌药物。我们最近的研究发现,一些来源于人的且具有维甲酸耐药的ATC细胞系THJ-21T、THJ-16T和THJ-11T,白藜芦醇对于前两者能够有效抑制其生长并引起细胞凋亡。表明该多酚化合物具有潜在的ATC治疗价值。然而,由于某些未知的原因,白藜芦醇对THJ-11T细胞系抑制作用不甚明显,因此研究白藜芦醇敏感性差异的内在机制对于临床个体化用药将具有深远意义。鉴于此,本课题进行了以下研究:(1)选用DEN(N-二乙基亚硝胺)、MNU(N-甲基-N-亚硝基脲)、DHPN(N-亚硝基二异丙醇胺)三种诱癌剂建立大鼠多器官肿瘤发生模型(DMD模型),并通过灌胃和腹腔注射白藜芦醇给药形式,对大鼠多器官癌前病变发生率和进展情况进行分析,进而验证白藜芦醇对多器官肿瘤的化学预防作用。(2)利用上述模型,通过一系列实验深入探讨白藜芦醇对甲状腺癌的预防作用并对其作用机制。(3)选用白藜芦醇不同敏感性的人未分化甲状腺癌细胞系THJ-16T和THJ-11T,在白藜芦醇不同时间处理内,通过系列实验方法,从细胞和分子两个层面分析未分化型甲状腺癌的白藜芦醇敏感性差异及其可能的分子机制。材料与方法:实验所用的SD大鼠是由大连医科大学实验动物中心提供,ATC细胞系THJ-16T和THJ-11T建立于柯普兰实验室,由大连医科大学肿瘤干细胞研究院刘强教授馈赠。首先构建了DEN/MNU/DHPN三种化学试剂诱发大鼠多器官肿瘤发生的动物模型,并采用IG(intragastric injection,灌胃)和IP(intraperitoneal injection,腹腔注射)白藜芦醇隔天给药方式进行预防干预并观察大鼠状态。30周后处理所有大鼠并对体重和主要器官重量进行记录,对组织器官标本进行观察并拍照。将各组大鼠的组织器官浸泡于10%中性福尔马林中固定,石蜡包埋,制备成组织切片,镜下观察并对各组大鼠多个器官的病变进行统计。对各组甲状腺癌前病变进行深入研究:采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定各组大鼠血清中癌胚抗原(CEA)及甲状腺球蛋白(Tg)的含量;采用免疫组织化学方法(IHC)对各组大鼠甲状腺组织中TTF-1、Tg、Ki67、PCNA表达情况进行测定;通过IHC和蛋白免疫印迹方法(WB)对NF-κB炎性信号通路进行检测。在活性氧水平与未分化型甲状腺癌细胞白藜芦醇敏感性的相关性研究中,THJ-16T和THJ-11T细胞培养于含有5%和10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中,100μM白藜芦醇用于处理不同时间,采用MTT法、HE染色、DAPI染色、TUNEL染色以及Annexin V-PI双染等方法对白藜芦醇诱导ATC细胞凋亡作用进行检测分析,通过流式细胞术、免疫细胞化学(ICC)、蛋白免疫印迹(WB)等方法检测活性氧、抗氧化酶水平、Caspase蛋白以及SULTs表达水平,进而探讨未分化甲状腺癌白藜芦醇敏感性差异和分子机制。结果:一、白藜芦醇对化学诱导SD大鼠多器官肿瘤发生的预防作用1.白藜芦醇治疗安全性评价白藜芦醇IP组大鼠的平均终体重(591.3±38.4 g)和IG组(580.5±37.7 g)高于DMD模型组(549.1±42.1 g;P<0.05);略低于正常饲养组(610.1±24.8 g;P>0.05)。甲状腺、肝、肺、肾、脾的相对器官重量各组间均无显著性差异(P>0.05)。2.白藜芦醇对多器官肿瘤发生具有预防作用正常饲养组中大鼠的各器官均未出现病变,而DMD模型组、白藜芦醇IG组和IP组中的大鼠甲状腺癌前病变(增生和腺瘤)的发生率为53.3%、33.3%、26.7%;肝癌的发生率为26.7%、6.7%、6.7%;肺纤维化增生的发生率为20.0%、13.3%、6.7%;结肠淋巴增生的发生率为46.7%、26.7%、26.7%。二、白藜芦醇对化学诱导SD大鼠甲状腺肿瘤的预防作用及其机制1.白藜芦醇给药后在甲状腺组织中的含量及可用性白藜芦醇(20 mg/kg)给药30分钟后,IG组与IP组的大鼠甲状腺组织中白藜芦醇的平均浓度分别为1.278±0.419 nmol/g(0.256μM)和1.752±0.398 nmol/g(0.351μM)。100μM白藜芦醇60分钟处理后,5×10~6个THJ-16T细胞胞内白藜芦醇的浓度为0.362±0.126μM。100μM白藜芦醇处理THJ-16T细胞中白藜芦醇的浓度比IG和IP给药后甲状腺组织中白藜芦醇浓度高41.4%、3.1%。2.白藜芦醇能够延缓甲状腺癌前病变的发生甲状腺癌前病变(增生/腺瘤)可以在DMD模型组发现,发生率为53.3%,IG组发生率和IP组发生率分别为33.3%和26.7%。DMD模型组中单发和多发乳头状腺瘤分别为13.3%(2/15例)和13.3%(2/15例),白藜芦醇IG组为6.7%(1/15例)和0%(0/15例),白藜芦醇IP组6.7%(1/15例)和0%(0/15例)。病变(增生/腺瘤)的平均面积在DMD模型组为0.599±0.037 mm~2,分别高于白藜芦醇IG组(0.397±0.062 mm~2)和白藜芦醇IP组(0.319±0.040 mm~2)的50.9%及87.8%,差异有统计学意义(P<0.05)。3.白藜芦醇给药可降低大鼠血清Tg和CEA水平大鼠血清Tg平均浓度在IP组中为3.327±0.304μg/L,在IG组为3.512±0.377μg/L,均低于DMD模型组的4.139±0.628μg/L(P<0.05),高于正常饲养组的3.053±0.365μg/L,分别高出9.0%和15.0%,但无统计学差异(P>0.05)。大鼠血清CEA平均浓度在IP组为8.111±0.604μg/L,IG组为8.280±0.541μg/L,均低于DMD模型组的9.306±1.049μg/L(P<0.05),高于正常饲养组的7.373±0.225μg/L,分别高出10%(P>0.05)和12.3%(P>0.05)。此外,我们还对同一实验组中发生不同病变大鼠的血清CEA、Tg水平进行测定,发现在腺瘤性大鼠和增生性大鼠均高于正常大鼠(P<0.05)。4.不同生长相关因素的表达水平在正常饲养组中大鼠甲状腺组织中Ki67与PCNA低表达,在DMD模型组中则表达水平明显升高,且在增生和腺瘤组织中高于病变旁的正常甲状腺组织。但在白藜芦醇处理之后则出现Ki67和PCNA的表达下调。TTF-1可在所有组别大鼠甲状腺上皮细胞的细胞核中检测到,尤其是DMD模型组中表达明显,而白藜芦醇处理后表达下降。同样的,Tg在DMD模型组表达较高,白藜芦醇治疗后甲状腺组织中下降,但仍高于正常饲养组甲状腺组织。5.白藜芦醇抑制NF-κB/p65、IL-6和COX-2的表达IHC和western blotting结果表明,在正常对照组中大鼠甲状腺组织NF-κB/p65、IL-6和COX-2表达水平较低。在DMD组中,NF-κB/p65、IL-6和COX-2的表达明显上调。IG组和IP组NF-κB/p65、IL-6和COX-2水平低于DMD模型组,但高于正常饲养组。相反,Ik Bα在正常饲养组的甲状腺组织中以高水平表达并且在DMD处理后被下调,尤其是在DMD模型组中。三、活性氧水平与未分化型甲状腺癌细胞白藜芦醇敏感性的相关性分析1.未分化型甲状腺癌不同细胞系对白藜芦醇不同敏感性HE和MTT结果显示,100μM白藜芦醇处理THJ-11T不同时间,细胞数量基本没有变化;而THJ-16T则表现出对白藜芦醇敏感,值呈现时间依赖性降低(12h,P<0.05;24h和48h,P<0.01)。2.白藜芦醇可以诱导THJ-16T细胞凋亡DAPI染色结果显示,THJ-16T细胞在24h和48h出现核浓缩,染色加深,或核染色质呈新月形聚集于核膜一边的细胞凋亡的典型特征;THJ-11T则没有出现上述特征。此外,TUNEL染色结果显示,THJ-16T细胞在白藜芦醇处理48h后出现了凋亡。Annexin V/PI法检测结果显示,白藜芦醇未处理与处理48h后THJ-11T细胞凋亡率为0.99±0.42%和1.07±0.41%(P>0.05);THJ-16T细胞凋亡率为2.67±0.49%和21.27±2.76%(P<0.05)。3.白藜芦醇处理后THJ-11T,THJ-16T细胞中ROS水平的变化与0h时的ROS基础水平进行比较,THJ-16T细胞在6h、12h、24h(P<0.01)和48h(P<0.05)升高,在THJ-11T细胞中ROS水平无明显变化(P>0.05)。荧光显微镜观察结果与流式细胞术结果一致。4.白藜芦醇导致THJ-16T细胞线粒体损伤白藜芦醇未处理的THJ-11T与THJ-16T细胞,结构完整,线粒体呈棒状,形态饱满规则,线粒体嵴清晰且排列整齐。白藜芦醇处理48小时后THJ-11T细胞结构和线粒体没有发生形态学的改变,而THJ-16T细胞内的线粒体表现为线粒体肿胀,线粒体内的嵴扩张,模糊不清甚至消失,可见空泡形成,细胞核破碎,向边界凝集。5.白藜芦醇处理后THJ-16T细胞中SOD2与CAT表达下调ICC与Western Blotting检测THJ-11T,THJ-16T中白藜芦醇处理后相关抗氧化酶的表达,结果显示,在白藜芦醇处理后THJ-16T中SOD2与CAT的表达随着药物处理时间的增加而强度明显下降,THJ-11T中SOD2与CAT的表达未发生明显变化。6.白藜芦醇处理后caspase-9和caspase-3蛋白表达在100μM的白藜芦醇处理THJ-16T细胞48小时后,pro-caspase-9和-3的表达水平分别下降了15.3%和20.8%,active-caspase-9和-3分别上升了2.3倍和2.4倍。THJ-11T细胞的上述参数水平几乎保持不变。7.白藜芦醇处理后THJ-11T、THJ-16T细胞中的SULTs的表达THJ-11T与THJ-16T中的总SULT1A1和SULT1C2水平分别比正常大鼠甲状腺组织低17.1%和56.5%。THJ-11T细胞中的SULT1A1和SULT1C2在白藜芦醇处理后增加16.1%和5.0%,而在白藜芦醇处理THJ-16T细胞中基本保持不变。结论:一、建立了化学诱导SD大鼠多器官肿瘤发生模型。二、白藜芦醇给药可改善DMD诱导后大鼠的健康状况。三、白藜芦醇能够有效抑制甲状腺、肝、肺以及结肠癌前病变的发生和发展。四、灌胃与腹腔注射白藜芦醇可以在大鼠甲状腺组织中得以检测到,其浓度与100μM白藜芦醇处理体外培养的细胞内白藜芦醇浓度相近,表明白藜芦醇预防甲状腺癌发生和发展方面具有应用价值。五、全身给予白藜芦醇,通过抑制增殖和抑制NF-κB介导的炎症反应,可以有效降低化学诱导的致癌模型中甲状腺癌相关病变的发生率。六、口服给药可以达到与腹腔注射给药途径相似的治疗效果,因此更适合于长期用于甲状腺癌的预防。七、不同未分化型甲状腺癌细胞系对白藜芦醇敏感性不同,THJ-11T不敏感,THJ-16T敏感。八、白藜芦醇下调了其敏感细胞系THJ-16T细胞中SOD2和CAT的表达。九、白藜芦醇诱导ATC细胞凋亡的机制可能是通过增加ROS的产生,导致线粒体氧化损伤,引起caspase-9和caspase-3激活,最终诱导细胞凋亡。十、白藜芦醇敏感性差异的原因可能与其代谢酶SULTs表达水平成负相关所致,即代谢酶的表达越高,白藜芦醇敏感性越差。