均相时间分辨荧光免疫分析检测降钙素原方法的建立

• 作 者: 陈华鑫
• 出 处: 长春理工大学
• 发表日期: 2020年01期
• 关键词: 时间分辨荧光免疫分析 荧光稀土螯合剂 荧光特性 免疫标记

本研究成功合成出两种稀土荧光螯合剂并对通过核磁氢谱与质谱对结构进行确认,对它们的荧光性质的研究结果显示两种稀土荧光螯合剂均保持有三价铕离子的特征激发峰与发射峰,其中Eu³⁺?bpy.bpy.py（CO₂H）₂的最大激发波长为312nm,最大发射波长为598nm和615nm,Eu³⁺?bpy.bpy.py[CONH（CH₂）NH₂]₂的最大激发波长为311nm,最大发射波长为597nm和616nm。两种稀土螯合剂的荧光强度均与浓度呈线性相关,线性方程分别为Eu³⁺?bpy.bpy.py（CO₂H）₂:y=310x-565.98,R²=0.999;Eu³⁺?bpy.bpy.py[CONH（CH₂）NH₂]₂:y=310x-1930,R²=0.999。荧光寿命分别为1064μs与398μs;量子产率分别为10.1%与12.1%。两种稀土螯合剂的荧光性质满足时间分辨荧光免疫分析的需求。以Eu³⁺?bpy.bpy.py[CONH（CH₂）NH₂]₂为基础进行修饰,合成并通过质谱确认得到Eu³⁺?bpy.bpy.py[CONH（CH₂）NHCOCH₂OCH₂COOH₂]₂。最大激发波长为312nm,最大发射波长为598nm和615nm,荧光强度与浓度线性方程为y=310x-1041.4,R²=0.999。利用DCC/NHS作为脱水剂,在DMAP的催化作用下使螯合剂与抗降钙素原检测抗体（anti-PCT detection antibody）相结合。优化标记条件后通过发现Eu³⁺?bpy.bpy.py[CONH（CH₂）NHCOCH₂OCH₂COOH₂]₂与抗体最佳标记条件为:螯合剂与DCC/NHS的摩尔比为1:4:6,室温反应6h,与抗体蛋白以20:1的摩尔比反应10h,可以得到标记比为10的稀土荧光螯合剂标记抗体。ELISA检测结果确认标记后抗体蛋白效价为1:800。利用标记的抗降钙素原检测抗体（anti-PCT detection antibody）与抗降钙素原包被抗体（anti-PCT coating antibody）构建检测降钙素原的时间分辨免疫荧光分析方法,实验结果表明,anti-PCT coating antibody的最佳稀释比例为1:200,anti-PCT detection antibody的最佳稀释比例为1:400,最佳孵育时间为60min,在0.5⁵0ng/mL浓度范围内,检测荧光信号强度与抗原浓度呈线性相关,线性方程为y=2552.6x+4.8222,R²=0.9928,灵敏度为0.5ng/mL,CV<10%,重复性良好,与常见临床标志物AFP,CEA,CRP无交叉反应。