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猪伪狂犬病(Pseudorabies，PR)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的多种家畜及野生动物共患的一种广泛流行的急性传染病，以发热、奇瘁（除猪外）、呼吸及神经系统疾病为特征，妊娠母猪发生流产或死胎。该病在猪场多呈暴发流行，目前尚无治疗PR的有效药物，因此疫苗接种是控制该病发生和流行的主要措施。自2011年以来，我国多个省份接种疫苗的猪群中发生严重的猪伪狂犬病，新出现的伪狂犬病病毒变异株对各个年龄的猪均具有致病性，意味着现有疫苗可能不能对当前流行株提供完全的保护，使我国养猪业面临巨大风险。本研究以实验室分离的猪伪狂犬病变异株PRV-XJ株为材料，通过Cre-loxP系统构建了不带标记基因的gE/gI双缺失株及gE/gI/TK三缺失株，对重组病毒的生长特性及免疫保护力进行了初步探究，为研制伪狂犬病变异株重组疫苗及病毒载体疫苗奠定基础。 1、伪狂犬病毒gE/gI双缺失株及gE/gI/TK三基因缺失株的构建 以vPRV-XJ株基因组DNA为模板，分别扩增gE/gI基因、TK基因两侧序列作为同源臂，以增强型绿色荧光蛋白EGFP为筛选标记，构建带有loxp位点的pBKSgILgER-GFP、pBKSTKLR-GFP转移载体。提取PRV-XJ株感染的Vero细胞总DNA，用磷酸钙沉淀法，将pBKSgILgER-GFP转移载体和病毒DNA共转染Vero细胞，出现80％以上病变时收获病毒液，通过空斑纯化法获得带有EGFP的重组病毒rPRV-gE-/gI--GFP。使用Cre重组酶处理重组病毒rPRV-gE-/gI-GFP基因组DNA，并进行抽提，制备磷酸钙-DNA复合物，转染至Vero细胞，空斑纯化获得剔除EGFP的双基因缺失病毒rPRV-gE-/gI-，基因组PCR产物测序结果显示缺失2287 bp。将rPRV-gE-/gI-基因组DNA与pBKSTKLR-GFP转移载体共转染，空斑筛选获得带有荧光的重组病毒rPRV-gE-/gI-/TK--GFP，同样使用Cre重组酶处理后，磷酸钙沉淀法转染到Vero细胞，空斑纯化筛选出剔除EGFP的三基因缺失毒株rPRV-gE-/gI-/TK-。基因组PCR产物序列分析显示TK基因内部缺失498 bp。 2、缺失株复制能力及免疫效力的初步研究 对gE/gI双缺失株、gE/gI/TK三缺失株的复制能力及免疫效力初步研究发现，vPRV-XJ、rPRV-gE-/gI-、rPRV-gE-/gI-/TK在Vero细胞上的最高滴度分别为10-7500TCID50/mL、10-6667TCID50/mL、10-6571TCID50/mL，与野毒株相比，缺失gE/gI双基因和gE/gI/TK三基因，均对病毒的增殖有一定影响，两种缺失毒株复制能力差异不大。vPRV-XJ、rPRV-gE-/gI-、rPRV-gE/gI-/TK-对小鼠的LD50分别是1.3×103TCID50、7.9×104TCID50、大于1×106TCID50，结果表明，与野生株相比，gE/gI双缺株对小鼠毒力有所降低，gE/gI/TK三缺株毒力显著降低。 以1047TCID50剂量rPRV-gE-/gI-/TK-免疫小鼠，rPRV-gE-/gI-/TK-组抗体水平普遍高于Bartha K61免疫组，以vPRV-XJ攻毒后，rPRV-gE/gI-/TK-免疫组的保护率为87.5％，BarthaK61免疫组的保护率为12.5％。以1063TCID50剂量rPRV-gE-/gI-/TK-免疫无母源抗体商品猪后，未出现异常临床症状，PRV特异性抗体水平逐步提高。使用vPRV-XJ毒株攻毒后，免疫猪无临床症状和病理变化，可以完全抵抗vPRV-XJ的攻击。结果表明，rPRV-gE-/gI-/TK-安全性好，具有良好的免疫原性，对PRV变异株攻击有保护作用，有望成为防控当前流行的伪狂犬变异株的疫苗候选株。