论文部分内容阅读
全球癌症调查数据显示，每年因肺癌而导致的死亡人数达到100万，在肺癌的所有病理分型中，非小细胞肺癌(NSCLC)占80％-85％。NSCLC患者由于早期多缺乏症状，就诊时往往已处于肺癌晚期，从总体而言，NSCLC患者预后不佳，5年生存率仪有14％[5-7]。随着对于包括肺癌在内的肿瘤分子水平的发病机制的不断阐明，针对这些机制的靶向治疗已经成为可能。
阿斯利康公司推出的抗肿瘤新药吉非替尼(gefitinib，ZD839，商品名Iressa)是第一个被批准上市用于治疗晚期NSCLC的靶向药物。吉非替尼是一种能口服的小分子EGFR酪氨酸激酶抑制剂。该药能进入细胞内，从而抑制EGFR的自磷酸化作用并阻断下游信号，使肿瘤细胞发生凋亡。
表皮生长因子受体(EGFR，又称ErbB1或HER1)是一种跨膜糖蛋白，属于HER家族的一员。EGFR分布于细胞膜的表面，其结构由三部分组成：细胞外配体结合域、跨膜区、细胞内酪氨酸激酶域。当与其配体结合后，EGFR可在细胞表面形成同源或异源二聚体，引起细胞内酪氨酸激酶域活化随后参与信号通路的细胞内蛋白发生自磷酸化而激活，从而调节基因转录。激活的EGFR可刺激肿瘤的生长与进展，包括促进细胞增殖、血管生成、肿瘤细胞浸润、转移和抑制细胞凋亡。
正是由于上述特点，EGFR成为倍受关注的肿瘤靶向治疗热。吉非替尼已经在临床上使许多非小细胞肺癌患者受益。但多项国际临床试验结果表明，该药总体疗效低于30％，因此合理选择治疗对象成为当前普遍关注的问题。
Lynch等和Paez等率先报道，有EGFR酪氨酸激酶编码区基因突变的肺癌细胞，吉非替尼治疗的有效率在80％以上，而对无突变的野牛型肿瘤，该药物则基本无效。据Lynch等报道，非小细胞肺癌患者体内编码EGFR酪氨酸激酶(TK)结构域的基因突变存在两个热点：(1)EGFR 19外显子内的框内缺失突变。19外显子的碱基缺失主要是第746～752位密码子的碱基缺失突变，导致EGFR蛋白中氨基酸(ELREATS)序列丢失。(2)发生在EGFR 21外显子内2573位核苷酸的点突变(T>G)，引起EGFR蛋白中该位点的氨基酸由亮氨酸转变为精氨酸(L858R)。
通过对EGFR基因突变进行检测，可以筛选出最合适的患者接受有针对性的靶向治疗，从而提高药物疗效，使患者最大程度的受益，同时避免不合理用药所造成的患者医疗费用负担和社会医疗资源浪费。
本课题将以围内外文献数据为基础，分别针对EGFR第19外显子最常见的7种缺失突变类型(Del E746-A750(1)，Del E746-A750(2)，Del E746-T751，Del L747-T75linsP，Del L747-S752insS，Del L747-S752ins V1，Del L747-S752)，以及21外显子2573位核苷酸点突变(L858R)设计特异性探针，以实时荧光PCR法为技术平台，对上述总共8种最常见的EGFR突变类型进行检测。
本课题成功构建了EGFR第19外显子最常见的7种缺失突变类型的质粒模板，以及EGFR第21外显子的2573位点突变的质粒模板。利用质粒模板对实时荧光PCR检测体系和反应条件进行摸索，对该体系的特异性、灵敏度进行了检测与实验室评价。并采用本课题建立的实时荧光PCR体系对非小细胞肺癌组织EGFR突变进行了检测，与测序结果进行比较。为今后在临床上应用实时荧光PCR法对非小细胞肺癌组织EGFR突变进行检测奠定了基础。
实验目的：
建立一种用实时荧光PCR法检测表皮生长因子受体(EGFR)基因突变的方法，为探讨实时荧光PCR法用于检测非小细胞肺癌组织EGFR基因突变在临床检测中的应用打下基础。
实验方法：
一、实时荧光PCR检测EGFR基因方法的建立
依据引物探针设计原则，设计分别针对EGFR19外显子和21外显子的引物及特异性探针，经软件比对和实验确认。提取经测序验证的无EGFR突变者gDNA，经分子克隆获得野牛型质粒模板；利用定点突变技术获得突变型质粒模板。借助质粒模板优化实时荧光PCR体系，摸索PCR反应条件，并检测体系的灵敏度及特异性，同时建立PCR法应用于肺癌标木检测中的结果判读标准。
二、实时荧光PCR法在非小细胞肺癌组织检测EGFR突变中的初步应用
采用实时荧光PCR法对非小细胞肺癌组织进行检测，并与直接测序法进行比较。对PCR法和测序法检测结果不一致的样品，采取克隆筛选突变型质粒进行测序的方法进行进一步验证。
实验结果：
一、成功构建野生型质粒模板和待检测突变类型的突变型质粒模板。经过优化的PCR检测体系具有良好灵敏度与特异性，可以进一步用于对肺癌标木样品的检测。
二、实时荧光PCR法与测序法比较，其检测灵敏度符合率为100％(10／10)，特异性符合率为90％(9／10)。对PCR检测结果阳性而测序结果阴性的样品进行克隆筛选得到阳性质粒，并进行测序验证，结果证明该样品确为突变型样品。
结论：
一、本课题建立的实时荧光PCR检测EGFR突变方法灵敏度高、特异性好，简单易行，成本低廉，能够实现在各医院及临床检验中心普及应用。
二、实时荧光PCR法检测非小细胞肺癌组织EGFR突变位点，可以灵敏特异地将有突变的患者与没有突变的患者区分开来，因此其可以作为筛选潜在受益患者的检测方法。