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研究目的1.以健康自然衰老BALB/c小鼠为研究对象,检测青年组(2月龄)、中年组(8月龄)和老年组(20月龄)中小鼠脾脏组织学、干细胞相关转录因子及老化相关转录因子的mRNA表达量的增龄性变化。2.以健康自然衰老的的BALB/c小鼠为研究对象,采用流式细胞术检测青年组(2月龄)、中年组(8月龄)和老年组(20月龄)中小鼠T淋巴细胞亚群的变化。3.分离、培养、鉴定和比较不同年龄段C57BL/6J小鼠骨片来源的骨髓间充质干细胞,为第4部分骨髓间充质干细胞移植实验提供足够的同种异基因骨髓间充干细胞。4.通过尾静脉移植同种异基因骨髓间充质干细胞,观察其对不同年龄段BALB/C小鼠脾脏的影响。方法1.检测BALB/c小鼠脾脏的增龄性变化,共分为3组：青年组(2月龄),中年组(8月龄)和老年组(20月龄),每组各5只。分别取脾脏,观察检测以下内容：(1)脾脏组织学变化,(2)实时荧光定量PCR技术(Real-time PCR)检测脾脏老化相关转录因子AUF1、P16INK4和脾脏干细胞相关转录因子Oct3/4、Sox2、 KLF4、c-MYC、NANOG、HOX11、ADAM12、GIL3、Wnt的mRNA表达量的增龄性变化。2.检测BALB/c小鼠脾脏T细胞的增龄性变化,共分为3组：青年组(2月龄),中年组(8月龄)和老年组(20月龄),每组各5只。分别取脾脏,制备脾脏单细胞悬液,用流式细胞仪检测：CD3+、CD4+、CD8+、CD8+CD28+、CD8+CD441owCD62Lhigh、 CD8+CD441owCD62LhighSca-1+的增龄性变化。3.通过骨片消化法从3周龄和22月龄C57BL/6J小鼠的胫骨和股骨中分离骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs),进行培养扩增。观察培养过程中的细胞形态、并对P6代细胞进行流式检测、成骨诱导及成脂诱导,并比较不同年龄段小鼠BMSC的区别。4.通过尾静脉注射CM-Dil标记的1×107数量同种异基因(C57BL/6J)3周龄小鼠BMSCs,观察其对不同年龄段BALB/c小鼠脾脏的影响。青年注射组(2月龄),中年注射组(8月龄),老年注射组(20月龄),每组各5只小鼠。细胞注射1个月后取小鼠脾脏,进行以下检测：(1)制备脾脏单细胞悬液,流式细胞仪检测：CD3+、CD4+、CD8+、CD8+CD441owCD62Lhigh、CD8+CD441owCD62LhighSca-1+的比例。(2) Real-time PCR仪检测以下老化相关及脾脏干细胞相关转录因子的表达水平：AUF1、P16INK41Oct3/4、Sox2、KLF4、c-MYC、NANOG、HOX11、ADAM12、GIL3、Wnt。将所得结果与第一部分和第二部分同年龄段小鼠的实验结果进行比较,初步探索异基因干细胞注射后对于脾脏的影响。结果第一部分脾脏组织学结果显示：老年组小鼠脾脏组织结构更加紊乱,巨噬细胞和含铁血黄素增多。脾脏组织real-time PCR检测结果显示,老化相关基因P16INK4表达量随增龄性升高,AUF1基因表达量随增龄性下降；脾脏干细胞相关基因Oct3/4、Sox2、 KLF4、c-MYC、NANOG、HOX11、ADAM12、GIL3、Wnt的表达量,均随增龄性下降,且青年组(2月龄)和老年组(20月龄)比较,均有显著性差异。第二部分(1)脾脏CD3+T细胞在总细胞中的比例,在青年组、中年组及老年组中分别是47.8%、50.1%和36.3%。老年组与青年组、中年组相比较,CD3+T细胞比例明显下降,差异均具有统计学意义(p<0.05)。青年组和中年组比较差异均无统计学意义。(2)脾脏中CD4+细胞在总细胞中的比例,在青年组、中年组及老年组中分别是24.2%、22.7%和21.0%。各组间差异均无统计学意义。(3)脾脏中CD8+细胞在总细胞中的比例,在青年组、中年组及老年组中分别是17.8%、15.0%和9.8%。老年组分别与青年组、中年组相比较,CD8+T细胞比例明显下降,差异具有统计学意义(p<0.05)。青年组和中年组比较差异均无统计学意义。(4)脾脏中CD8+CD28+细胞在总细胞中的比例,在青年组、中年组及老年组中分别是13.1%、7.3%和6.0%。老年组与青年组、中年组相比较,CD8+T细胞比例明显下降,差异均有高度统计性意义(p<0.001)。青年组和中年组比较无显著性差异。(4)脾脏中CD8+CD44lowCD62Lhigh细胞在脾脏总细胞中所占的比例,在青年组、中年组及老年组中分别是4.5%、2.2%和3.7%,各组间比较差异均无统计学意义。该细胞在CD8+T细胞中所占的比例,在青年组、中年组及老年组中分别是24.5%、12.7%和16.5%,各组间比较差异均无统计学意义。(5)脾脏中CD8+CD44lowCD62LhighSca-l+细胞在脾脏总细胞中所占的比例,在青年组、中年组及老年组中分别是1.4%、1.8%和3.2%,各组间比较差异均无统计学意义。该细胞在脾脏CD8+细胞中所占的比例,在青年组、中年组及老年组中分别是14.8%、12.6%和26.8%,各组间差异也均无统计学意义。第三部分骨片消化法在10天左右可分离出BMSCs,经过传代后,在P6代可得到纯度较高的BMSCs。P6代细胞进行流式检测CDllb、CD45和CD29。其在不同年龄段小鼠BMSCs中的比例分别为：CD29(3周龄97.97%,22月龄小鼠94.7%)、CDllb(3周龄6.6%,22月龄小鼠8.1%)和CD45(3周龄2.68%,22月龄小鼠2.24%)。两个年龄段P6代细胞均可以成功向成脂和成骨方向诱导。第四部分同种异基因小鼠骨髓间充质干细胞移植后,CD3+和CD8+T细胞在青年组和中年组比例均下降(P<0.005),CD4+T细胞在中年组比例下降(P<0.01)。老年组CD3+T、CD4+T和CD8+T细胞的比例注射后均未见变化。CD8+CD44lowD62Lhihigh和CD8+CD44lowCD62LhighSca-1+细胞,注射前后比例在各年龄段也均未见变化。Real-timePCR结果显示：细胞注射后对青年组、中年组和老年组脾脏组织脾干细胞相关基因和老化相关基因可产生影响,且在不同年龄段产生的影响不一样。结论1.利用骨片消化法可得到质量较高的C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞,通过其细胞生物学特性观察、流式细胞术检测和多向诱导分化可证明其符合骨髓间充质干细胞(BMSCs)的标准,可应用于进一步的细胞治疗实验要求。且不同年龄段小鼠的BMSC的生长状态及分化潜能有区别。2. BALB/c小鼠脾脏组织和脾T淋巴细胞亚群具有增龄性的变化。同种异基因骨髓间充质干细胞移植后,可对脾脏组织和脾T淋巴细胞亚群产生影响,且在不同年龄段效果不同。本研究的创新点1.AUF1目前被报道的唯一可同时调控炎症、衰老和癌症的单一基因。本实验中首次对AUF1在小鼠脾脏内的增龄性变化进行了检测,发现AUF1的表达量出现了随增龄性下降的趋势。2.首次在普通小鼠体内对脾脏记忆性T细胞中的干性标记Sca-1进行了增龄性变化检测,结果显示,CD8+CD44l0CD62Lhi Sca-1+未出现增龄性变化。3.首次报道了脾脏干细胞相关转录因子(Oct3/4、Sox2、KLF4、c-MYC、NANOG、 HOX11、ADAM12、GIL3、Wnt)的增龄性变化。结果显示,这9个转录因子均出现了增龄性下降的趋势。4.通过移植同种异基因骨髓间充质干细胞,检测其在不同年龄段中对脾脏干细胞相关转录因子及老化转录因子AUF1的影响。结果表明,干细胞注射后会对某些基因的表达产生影响,且在不同年龄段小鼠的影响不同。