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背景:有研究发现,肠道菌群失衡与盐敏感性高血压有着密切的关联。Nicola Wilck[1]等人发现,盐敏感性高血压小鼠饲以高盐摄入14天后,收缩压和舒张压显著升高,同时发现肠道菌群中的以乳杆菌属为代表的8种菌属含量显著降低。在给予盐敏感性高血压小鼠穆氏乳杆菌治疗后,升高的收缩压及舒张压均显著降低,其中舒张压至正常水平。提示肠道菌群平衡状态的维持对于稳定血压有着重要作用,肠道菌群所需的氮源于结肠内的尿素,结肠内尿素含量的减少会引起肠道菌群的失衡,结肠内外尿素的转运是由表达于结肠上皮细胞细胞膜的UT-B转运的。我们课题组前期结果发现,UT-B基因缺失小鼠在喂食高盐饮食4W后,小鼠的平均动脉压明显升高。UT-B是由SLC14α1基因编码的尿素转运蛋白,广泛存在与肾脏、红细胞、脑、睾丸、肠道[2]、膀胱[3]等组织中,主要负责尿液的浓缩等过程[4]。研究显示,UT-B在结肠上皮细胞细胞膜上表达,但对其生理功能的研究较少。鉴于UT-B是介导尿素跨膜转运的膜蛋白,表达于结肠上皮细胞细胞膜的UT-B介导了尿素进入结肠,进而为结肠内菌群提供生存所需氮源,维持了结肠菌群平衡。我们推测,若UT-B基因缺失,会引起结肠内尿素浓度改变,导致结肠菌群失衡,进而导致小鼠盐敏感性高血压的发生。为验证表达于结肠的UT-B基因与肠道菌群失衡的关系,阐明基于UT-B基因缺失的肠道菌群失衡在小鼠盐敏感性高血压中的作用及相关机制。本研究选取UT-B基因缺失小鼠为研究对象,以野生型小鼠为对照,分别给予普通饮食和高盐饮食4W,分别观察小鼠饮水量及血压变化情况,检测结肠内尿素含量、结肠内菌群成分、短链脂肪酸含量、GPR41、Olfr78的表达。在分析肠道菌群及其代谢产物在小鼠盐敏感性高血压中的作用基础上,给与小鼠补充SCFAs 4w,观察补充SCFAs对小鼠盐敏感性高血压的作用,为盐敏感性高血压的防治提供新的治疗靶点。研究目的:确定UT-B基因在小鼠肠道的表达与作用,探讨UT-B基因缺失对小鼠结肠菌群平衡的影响,阐明基于UT-B基因缺失的肠道菌群失衡在小鼠盐敏感性高血压中的作用并分析相关机制,为盐敏感性高血压的防治提供新的思路和靶点。方法与结果:(一)第一部分:以UT-B基因缺失小鼠为研究对象,分析UT-B基因缺失对小鼠肠道菌群平衡的影响,探讨基于UT-B基因缺失的肠道菌群失衡在小鼠盐敏感性高血压中的作用。1.UT-B基因缺失小鼠的获得利用杂合子小鼠进行交配,获得遗传背景相同的UT-B基因缺失型纯合型小鼠和野生型小鼠,随后将不同基因型的小鼠进行基因鉴定,PCR结果显示,UT-B基因缺失型纯合小鼠,野生型小鼠以及杂合子小鼠的基因鉴定结果条带分别显示:仅在250bp处有一条带,仅在400bp处有一条带,分别在250bp和400bp处有一条带。2.UT-B基因在小鼠结肠的表达与定位取UT-B基因缺失小鼠和野生小鼠的同段位结肠,通过RT-PCR、Western-blot和免疫组织化学方法检测UT-B基因在野生型小鼠结肠的表达与定位,结果发现,UT-B表达于野生型小鼠结肠上皮细胞顶膜和腺窝,UT-B基因缺失小鼠未见表达。3.各组小鼠结肠内容物中尿素含量测定取UT-B基因缺失小鼠和野生小鼠的同段位结肠内容物,通过尿素试剂盒测定各组小鼠结肠内容物尿素含量,结果发现,UT-B基因缺失小鼠的肠内容中的尿素含量明显低于野生型小鼠结肠内容物尿素含量。(p<0.001)4.以UT-B基因缺失小鼠为研究对象,以野生型小鼠为对照,观察高盐饮食对UT-B基因缺失小鼠饮水量及平均动脉压的影响将相同月龄的雄性小鼠分为4组:UT-B+/+(高盐饮食组)UT-B+/+(普通饮食组)UT-B-/-(高盐饮食组)UT-B-/-(普通饮食组)。并同时仪器检测小鼠的血压状态,观察小鼠的每日饮水量,“无创法”检测各组小鼠平均动脉压。结果显示:高盐组饮水量明显高于普通饮食组;UT-B-/-(高盐饮食组)血压值明显高于其他组。5.UT-B基因缺失小鼠对结肠菌群平衡的影响以野生型小鼠为对照,检测UT-B基因缺失后,小鼠结肠菌群平衡变化;实验分组同前(UT-B+/+(高盐饮食组)UT-B+/+(普通饮食组)UT-B-/-(高盐饮食组)UT-B-/-(普通饮食组)。4 w后取各组小鼠同等段位的结肠内容物进行16S核糖体DNA鉴定(16S ribosomal DNA identification;16SrDNA)测序,对肠道菌群的丰富度,均匀度以及各菌群含量等进行对比。结果显示,与野生型小鼠喂食普通饮食和高盐饮食组相比,UT-B基因缺失型小鼠在喂食高盐饮食4周后,肠道菌群丰度,均匀度,多样性等明显降低,同时发现厚壁杆菌与拟杆菌的比值(即F/B)明显高于其他分组,提示在肠道菌群水平显示高血压的存在。6.基于UT-B基因缺失的肠道菌群失衡小鼠饲以高盐饮食后对结肠乙酸含量的影响SCFAs是肠道菌群的代谢产物,与盐敏感性高血压的产生和发展密切相关,基于上述结果发现UT-B基因缺失小鼠饲以高盐饮食会导致小鼠结肠菌群失衡,因此我们应用气相色谱法检测了肠道菌群的代谢产物之一乙酸含量的变化。结果显示:与野生型小鼠相比,UT-B基因缺失小鼠饲以高盐饮食后结肠内乙酸含量明显降低(P<0.01)。(二)第二部分:补充乙酸盐对UT-B基因缺失小鼠饲以高盐饮食所致盐敏感性高血压的影响1.补充乙酸镁对各组小鼠结肠乙酸盐含量的影响取相同月龄的雄性小鼠,动物分组如下:UT-B+/+(高盐饮食);UT-B+/+(普通饮食);UT-B-/-(高盐饮食);UT-B-/-(普通饮食);UT-B-/-(高盐饮食4W+乙酸盐4W);UT-B-/-(普通饮食4W+乙酸盐4W)。气相色谱检测结果显示:UT-B-/(高盐饮食)组小鼠结肠内乙酸镁含量与其他组小鼠相比明显降低;补充乙酸镁溶液4w后,UT-B-/(高盐饮食4W+乙酸盐4W)组小鼠乙酸含量显著增加(P<0.05)。2.补充乙酸镁对各组小鼠结肠SCFAs受体表达的影响SCFAs是通过与其受体结合而发挥调节血压的作用的,因此我们检测了各组小鼠SCFAs受体表达情况。RT-PCR结果显示:补充乙酸镁4w后,Olfr78 mRNA在UT-B-/-H组的表达最强,UT-B-/-H+acetate组的表达最弱;GPR41mRNA在UT-B-/-H+acetate组的表达最强,UT-B-/-H组的表达最弱。Western blot结果显示:Olfr78蛋白在UT-B-/-H组的表达最强,UT-B-/-H+acetate组的表达最弱;GPR41蛋白在UT-B-/-H+acetate组的表达最强,UT-B-/-H组的表达最弱。免疫组织化学结果显示:GPR41蛋白表达定位于结肠内分泌细胞L细胞,在UT-B-/-H+acetate组的表达最强,UT-B-/-H组的表达最弱;Olfr78蛋白表达定位于结肠隐窝内衬的上皮细胞,在UT-B-/-H组的表达最强,UT-B-/-H+acetate组的表达最弱。证实在给予乙酸镁饮食后,可使增高血压的受体Olfr78表达减弱,使降低血压的GPR41受体表达增强(P<0.05)。3.补充乙酸镁对各组小鼠平均动脉压的影响无创法血压监测小鼠血压,结果显示:在给予UT-B-/-H+乙酸镁组小鼠喂食乙酸镁溶液2W后,血压开始下降;4W后UT-8-/-H+乙酸镁组小鼠血压降至正常水平(由157±2.3mmHg下降至119±1.7mmHg),且继续喂食乙酸镁,血压不会降低至正常水平以下,对照组小鼠血压不变。证实补充乙酸盐可缓解UT-B基因缺失导致的小鼠盐敏感性高血压。结论:(一)UT-B基因缺失引发的肠道菌群失衡导致小鼠肠道菌群的代谢产物短链脂肪酸(SCFAs)含量的减少。(二)小鼠肠道菌群的代谢产物短链脂肪酸(SCFAs)含量的减少诱导UT-B基因缺失导致的小鼠盐敏感性高血压的产生。(三)补充乙酸盐可缓解UT-B基因缺失导致的小鼠盐敏感性高血压。