论文部分内容阅读
P选择素糖蛋白配体1(PSelectinglycoproteinligand1，PSGL-1)广泛分布于免疫细胞表面，在生物体内可与P、L、E选择素结合。在炎症发生、发展中有重要作用。主要表现为免疫细胞上的PSGL-1与炎症部位血管内皮上的P选择素结合，并可在内皮细胞上滚动，最后透过血管壁渗透到炎症部位。
作者构建了人PSGL-1黑色素瘤细胞系A2058转染细胞系，实验结果表明，该转染细胞系可在体外培养中长期稳定表达PSGL-1蛋白。从培养板上分离培养单个生长的PSGL-1转染细胞克隆，用12孔或24孔板扩大培养。待细胞生长至足够数量，取部分细胞以小鼠抗人PSGL-1抗体做WESTERNBLOT筛选。取PSGL-1高表达细胞做扩大培养。野生型PSGL-1分子由两个120KD同源双体通过二硫键连接而成，总分子量240KD。用非变性条件电泳，A2058PSGL-1转染细胞裂解液样品可见240KD处明显小鼠抗人PSGL-1抗体阳性杂交带(附录一fig1左图)。用变性条件电泳，A2058PSGL-1转染细胞裂解液样品则可见120KD处明显小鼠抗人PSGL-1抗体阳性杂交带。对照A2058pCDN-A3转染细胞裂解液样品无PSGL-1抗体阳性杂交带。小鼠抗人PSGL-1抗体免疫组织化学染色可见细胞表面棕黄色阳性染色。对照的载体转染细胞呈阴性染色(见附录一fig2)
与转染pCDNA3载体A2058细胞系相比，在形态学方面，转染PSGL-1后的细胞形态改变较大，由转染前细胞较长、形态伸展变为转染后细胞较短、较不伸展，免疫细胞化学染色也显示了同样的结果；低密度培养的PSGL-1转染细胞，生长细胞呈三角形伸展状态。与pDNA3载体转染A2058细胞或未转染A2058细胞系相比胞体较小。(见附录一fig3、4右图)高密度培养细胞镜下可见单个细胞形态同细胞低密度培养形态。生长细胞间彼此没有覆盖。接触的细胞间有明显边界，接触紧密。(见附录一fig5右图)而低密度培养的正常A2058细胞和转染pCDNA3载体A2058细胞系，生长细胞呈梭形或长梭形伸展状态。(见附录一fig3左图，中图。fig4左图，中图)高密度培养细胞，镜下可见单个细胞形态同细胞低密度培养形态。生长细胞可彼此覆盖，生长方式紊乱。接触的细胞间没有边界。将A2058PSGL-1转染细胞与载体转染细胞混合培养，观察在相同培养条件下两者生长形态是否有差别。小鼠抗人PSGL-1抗体免疫组织化学染色可见三角形棕黄色阳性染色细胞和梭形阴性染色细胞。(见附录一fig6)
在细胞黏附性方面，把A2058PSGL-1转染细胞与载体转染细胞对蛋白聚糖聚合物VersicanG3片段及Fibronectin黏附能力相比较比较表明，A2058PSGL-1转染细胞对培养板中G3片段及Fibronectin包被的区域有特异性黏附，而载体转染细胞没有这种特异性黏附。(附录一fig9)
A2058PSGL-1转染细胞迁移能力与载体转染细胞相比明显减弱。在18小时组、24小时组，载体转染细胞迁移到空白区的细胞数量明显高于A2058PSGL-1转染细胞。(附录一fig11，fig12,fig13)WesternBlot分析结果表明，两种细胞在以下蛋白分子的表达上没有区别：整合素β1、整合素α5、α3、Syk、整合素αv，E-Cadherin、collagen1。(附录一fig14，fig15,fig17)
A2058PSGL-1转染细胞与载体转染细胞相比较表达水平升高的蛋白分子有：N-Cadherin，β-catenin(附录一fig17)
用免疫荧光染色比较两种细胞ACTIN表达水平，两种细胞ACTIN表达水平没有明显差别。(fig18)
作者构建的PSGL-1A2058表达细胞株，可在体外培养中长期稳定地表达PSGL-1蛋白，冻存复苏后培养，其表达水平不受影响。我们在完成阳性细胞克隆筛选后，继续用筛选时的药物浓度(1000ug/mlG418)培养细胞，而不按照常规操作将药物筛选浓度减半，可能是使细胞一直保持转染蛋白长期稳定表达的原因之一。
有文献报道，细胞表面表达的PSGL-1分子和细胞的微管、微丝相关，而微管、微丝和细胞的形态学关系密切。在实验中我们发现，转染PSGL-1的细胞形态学和未转染细胞及转染空载体的细胞相比，细胞由伸展较大的梭形变为伸展较小的三角形。
PSGL-1对细胞形态学的影响有两种可能途径：一是直接影响，既PSGL-1本身即是形态相关分子，其在细胞膜上的表达与否直接影响细胞形态。我们构建了特异性SiRNA，用以封闭PSGL-1在小鼠巨噬细胞系SAW273.1中的表达，观察细胞形态是否发生变化。目前实验尚未完成。有文献报道，白细胞中PSGL-1细胞浆功能区可通过Syk蛋白与actin连接蛋白(moesin,ezrin)相联接，(Ana,U.,M.S.Juan.2002)。我们考虑是否PSGL-1转染细胞是否上调sky表达进而影响到actin表达，后者使细胞形态发生变化.试验结果表明，Syk蛋白在两种细胞中的表达没有差别.
PSGL-1对细胞形态学的影响另一个途径是间接途径，细胞表达PSGL-1后对其他分子的表达水平产生影响，后者使细胞形态学发生变化。在实验中我们发现，PSGL-1转染细胞N-Cardherin表达水平升高。N-Cardherin分子可通过β-catenin连接actin，此三者和细胞间的连接、细胞的结构和形态关系密切(Margaret,J.2003)。Westernblot结果也表明，β-catenin在PSGL-1转染细胞中表达显著升高.但在两种细胞中actin表达水平没有明显差别，因此，细胞形态上的改变可能由于N-Cardherin，β-catenin表达水平增高后，对actin的调控加强有关。
PSGL-1细胞高密度培养时，相接触的细胞间边界明显，且无重叠生长，亦可能和N-Cardherin表达水平增高有关。
实验中我们发现，PSGL-1转染细胞对细胞培养板黏附能力(非特异性黏附)能力下降。这说明细胞转染PSGL-1后，某些和黏附功能相关的分子在细胞表面表达减少。我们用WESTERNBLOT检测了几种整合素的表达情况，没有发现明显差别。细胞对培养板黏附能力下降的原因尚需进一步的工作来研究。
PSGL-1转染细胞可以结合细胞培养板包被的versicanG3片断，这和我们前期完成得酵母双杂交实验结果相一致.versican是一种细胞外基质蛋白，近来发现和细胞的增殖、黏附相关。酵母双杂交试验发现versicanG3片断可以和PSGL-1项结合.本试验结果再次证实了这一点。
PSGL-1转染细胞可以结合细胞培养板包被的Fibronectin蛋白表明，FN也是一种细胞外基质蛋白，在细胞增殖、黏附等方面体现出多种功能。FN和VersicanG3片段之间也有结合位点，因此，我们必须首先明确FN和PSGL-1之间的结合是否是由于A2058细胞内源性Versican的桥梁作用而引起的间接连接。Westernboltting结果表明，PSGL-1转染细胞中Versican基本呈阴性表达.因此我们考虑是否FN是否可以直接结合PSGL-1.应用免疫沉淀试验未得到阳性结果。因此,FN和PSGL-1转染细胞上那种分子结合目前尚不清楚。
本实验中转染PSGL-1细胞的迁移能力明显下降。其原因可能有两点：一是细胞形态变化引起。我们在实际工作中，细胞形态越长，其迁移能力越强。细胞形态越接近圆形，其迁移能力越弱。由于转染PSGL-1细胞形态呈三角形，而对照的载体转染细胞依然是长梭形，所以前者的迁移能力要弱于后者。另一个原因可能是由于N-Cardherin表达增高引起。N-Cardherin表达增高使细胞间的连接加强，使空白区边缘的细胞不能脱离其临近细胞而自由运动到待迁移区内。作者考虑,N-Cardherin，β-catenin表达增高使细胞内actin的调控得到加强，从而减少actin分子本身的自由运动，可能是细胞自由迁移的原因之一.
本文中作者构建了PSGL-1分子高效稳定表达细胞株。发现PSGL-1转染细胞的形态发生显著变化，细胞由伸展较大的梭形变为伸展较小的三角形。黏附功能方面，PSGL-1转染细胞对细胞培养板的黏附力下降；对细胞外基质蛋白versicanG3domain,Fibronectin有特异性黏附；高密度培养时可见细胞间呈黏附状态.体外培养的PSGL-1转染细胞自由迁移能力减弱.PSGL-1转染细胞N-Cadherin，β-catenin表达水平显著升高。为细胞形态，黏附，自由迁移能力发生变化的可能原因。