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目的:(1)建立三种小鼠睾丸精原细胞株GC-1细胞DNA损伤模型并分析其异同;(2)研究淫羊藿苷(Icarrin,ICA)对D-半乳糖(D-Galactose,D-Gal)致GC-1细胞DNA损伤模型的保护作用及分子机制。方法:1、三种GC-1细胞DNA损伤模型的建立及差异分析:分别采用40 J/m~2 UVB辐照GC-1细胞后培养0、0.5、1、2、4和6 h,不同浓度(0、50、100、150、200和250 m M)D-Gal处理GC-1细胞0、1、3、6、12、24、48和72 h,不同浓度(2.5、5、10、25和50μg/mL)博来霉素(Bleomycin,BLM)刺激GC-1细胞0、0.5、1、2、4和6 h,随后检测以下指标:(1)Western blot和免疫荧光法检测DNA双链断裂早期标记物磷酸化组蛋白H2AX(Phosphorylated H2AX,γ-H2AX)表达及定位;(2)免疫荧光法检测氧化性DNA损伤标记物8-羟基脱氧鸟苷(8-hydroxy-2-deoxyguanosine,8-OHd G)表达及定位;(3)Western blot法检测DNA损伤修复相关蛋白P-P53和P21表达水平,从而比较不同处理因素对GC-1细胞DNA损伤及修复的差异。2、我们将GC-1细胞分为正常对照组、DMSO处理组、150 m M D-Gal处理组、150 m M D-Gal加不同浓度ICA(0.125、0.25、0.5、1、2、4和8μM)处理组,不同浓度ICA预保护GC-1细胞12 h后加入D-Gal继续培养6 h,采用MTT法筛选ICA用药浓度。随后将GC-1精原细胞分为正常对照组、150 m M D-Gal处理组、不同浓度ICA(0.5、1、2和4μM)处理组,不同浓度ICA预保护 GC-1细胞12 h后加入150 m M D-Gal继续处理6 h,随后检测以下指标:(1)免疫荧光法检测γ-H2AX及8-OHd G表达及定位;(2)Western blot法检测γ-H2AX、P-P53和P21蛋白表达水平;(3)免疫荧光法检测碱基切除修复(Base excision repair,BER)相关蛋白8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶1(8-oxoguanine DNA glycosylase 1,OGG1)、脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶1(Apurinic/apyrimidinic endonuclease 1,APE1)和X线修复交叉互补基因1(X-ray repair cross-complementing 1,XRCC1)表达及定位;(4)Western blot法检测OGG1、APE1和XRCC1蛋白表达水平;(5)Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测GC-1细胞凋亡。结果:1、(1)Western blot和免疫荧光结果显示,UVB辐照后,γ-H2AX蛋白表达水平在4 h达到高峰,6 h开始下降,呈先升后降趋势;不同浓度D-Gal处理GC-1细胞不同时间后,γ-H2AX蛋白表达均在D-Gal浓度为150 m M时达到高峰,随后开始下降,我们采用150 m M D-Gal处理GC-1细胞0、1、3、6、12和24 h后,γ-H2AX蛋白表达水平在6 h达到高峰,随后开始下降,呈先升后降趋势;不同浓度BLM刺激GC-1细胞不同时间后,当BLM浓度在2.5-10μg/mL范围时,γ-H2AX蛋白表达水平逐渐升高,当BLM浓度在25-50μg/mL范围时,γ-H2AX蛋白表达水平在2 h达到高峰,4 h开始下降。(2)免疫荧光结果显示,在未处理的GC-1细胞中未检测到荧光,UVB辐照和BLM刺激后,8-OHd G在胞核和胞浆内均有表达,且随着培养时间越长,GC-1细胞核内表达逐渐增多;D-Gal处理后,8-OHd G主要表达在胞浆,在6 h达到高峰,随后开始下降;(3)Western blot结果显示,UVB辐照后,P-P53和P21蛋白表达水平逐渐升高,P-P53蛋白表达水平在2 h后开始显著升高,P21蛋白表达水平在6 h开始显著升高;不同浓度D-Gal处理GC-1细胞不同时间后,P-P53和P21蛋白表达水平均在D-Gal浓度为150 m M时达到峰值,150 m M D-Gal处理GC-1细胞不同时间后,P-P53蛋白表达水平在6 h达到高峰,P21蛋白表达水平在6 h开始显著增加,12 h达到高峰,24 h后P-P53和P21蛋白表达水平均下降;浓度为2.5-10μg/mL的BLM处理GC-1细胞不同时间后,P-P53和P21蛋白表达水平均逐渐升高,且趋势一致,而25-50μg/mL浓度的BLM处理GC-1细胞不同时间后,P-P53和P21蛋白表达水平均在2 h达到峰值,4 h后P-P53表达水平开始下降,P21蛋白几乎无表达。2、(1)免疫荧光结果显示,与正常对照组相比,D-Gal处理组中8-OHd G、γ-H2AX、P-P53和P21表达水平均上升,与D-Gal处理组相比,ICA不同浓度组(0.5、1、2、4μM)8-OHd G、γ-H2AX、P-P53和P21蛋白表达水平表达均下降。(2)Western blot结果显示,与正常对照组相比,D-Gal处理组中γ-H2AX、P-P53、P21蛋白呈上升的趋势,而不同浓度ICA处理后可下调其表达。(3)免疫荧光结果显示,与正常对照组相比,D-Gal处理组中BER通路相关蛋白OGG1、APE1和XRCC1表达均上升,而ICA不同浓度组可下调其表达。(4)Western blot结果显示,与正常对照组相比,D-Gal处理组中OGG1、APE1和XRCC1蛋白表达水平均显著上升,与D-Gal处理组相比,不同浓度ICA组OGG1、APE1和XRCC1蛋白表达水平均显著下调。(5)Annexin V-FITC/PI流式细胞术结果显示,D-Gal处理组GC-1细胞凋亡率较正常对照组增加,而给予ICA干预后细胞凋亡有所改善。结论:1、成功建立3种(UVB辐照、D-Gal刺激以及BLM刺激)GC-1精原细胞DNA损伤模型,且D-Gal处理GC-1细胞DNA损伤较轻,UVB辐照和BLM刺激GC-1细胞DNA损伤较重;2、ICA能够改善D-Gal诱导的GC-1细胞DNA损伤并抑制其凋亡,其机制可能与调节BER通路有关。