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2006年3月,公安部警犬技术学校2只警犬发病,经初步诊断后,疑似犬冠状病毒(CCV)病。我们对提供的犬冠状病毒(CCV)症状病犬的粪便,以犬肾传代细胞(MDCK)等多种细胞进行了病毒分离,结果分离到1株病毒,在荧光显微镜下观察到犬冠状病毒的特征,进而对该病毒进行了形态学、理化学、生物学鉴定以及RT-PCR鉴定等方面研究。最后将分离得到的CCV病毒S基因克隆到相应载体中构建重组质粒,这对进一步研究CCV病毒的原核表达工作以及基因疫苗的研制工作提供了必要的信息和资料,实验设计及结果为:1.从犬冠状病毒(CCV)症状病犬粪便中分离出一株病毒,采用物理化学实验、动物回归实验等方法进行鉴定。实验结果为:细胞培养证实该病毒有致细胞病变效应;物理化学鉴定结果表明,分离病毒核酸类型为RNA,对氯仿、乙醚敏感,对1%胰蛋白酶不敏感,耐酸性较强,具有一定的耐热性,无血凝性和红细胞吸附特性;中和试验证明该分离病毒是一种犬冠状病毒;动物回归实验表明,本次分离病毒株可以引起试验犬出现典型犬冠状病毒病症状。2.合成通用引物(2Bp,4Bm)和Matthew等设计的CCV S基因区特异性引物(CCVF2,CCVR2)对分离病毒进行RT—PCR反应及限制性内切酶BstXⅠ酶切鉴定,并将纯化的PCR产物成功地克隆到pGEM-T-easy载体中。结果为:通用引物(2Bp,4Bm)和特异性引物(CCVF2,CCVR2)扩增均得到预期片段250bp,以及514bp,并且BstXⅠ酶切CCVF2、CCVR2的PCR产物,于琼脂糖凝胶上可见到大小为187 bp和327 bp两个核苷酸片段。回收引物CCVF2,CCVR2扩增得到长度约为514 bp较亮的DNA片段,并将其直接克隆到pGEM-T-easy载体中,转化E. coli JM109,并扩增培养,对重组质粒采用CCV特异性引物(CCVF2,CCVR2)进行PCR,得到预期扩增片段514bp,测序结果与GenBank的CCV序列进行比对,与之相符。结论:1.形态学、理化学、生物学及动物回归实验等多方面鉴定,证明所分离病毒为犬冠状病毒.RT-PCR反应结果,BstXⅠ酶切鉴定均得到预计扩增片段,证明所分离病毒为犬冠状病毒.2.回收犬冠状病毒特异性引物CCVF2,CCVR2扩增的S蛋白特异性基因片断并将其克隆入pGEM-T-easy载体中,进行PCR鉴定及测序,结果表明成功构建了pGEM-T-easy/CCV重组质粒.3.S基因序列分析比较发现,分离培养出的CCV病毒和CCV TN-449株(AY878318.1)同源性非常高,以目前所测定的序列比较达到了100%.