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背景和目的肺癌目前是我国发病率和死亡率最高的恶性肿瘤,严重威胁人们的生命健康,也给社会带来了极大的经济和医疗负担。虽然早期诊断一定程度上改善了肺癌的预后,但目前肺癌的总体5年生存率仍不到20%。根据疾病的病理类型,肺癌主要包括小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)和非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC),其中NSCLC占肺癌总数的85%左右,是主要的肺癌类型。肺癌患者多诊断于疾病的晚期,含铂两联经典化疗方案仍然是晚期肺癌最常用的治疗手段,但化疗药物不良反应和个体应答差异使其应用受限。因此,具有抗肿瘤作用或化疗增敏作用药物的发现和应用对肺癌的治疗有非常重要的意义。微小RNA(microRNA,miRNA)是一种具有调控功能的内源性短RNA,长度约为22个核苷酸,可通过结合靶基因的mRNA,参与mRNA的翻译抑制或裂解,进而在动植物体内发挥重要的调控作用。miRNA在多种实体恶性肿瘤细胞的增殖,侵袭和凋亡的调控中起重要作用,并可能参与肿瘤细胞对顺铂敏感性的调控。miRNA在体内存在复杂的调控网络,高通量测序技术的应用使得差异性表达miRNA的筛选易于实现,且多个miRNA数据库如Targetscan、miRBase、microRNAorg、PITA、miRDB等可以对miRNA的靶基因进行预测分析,完成miRNA作用通路的预测。近年来中药因其相对较低的毒性而受到越来越多的关注和应用。黄芩素(baicalein)是一种从植物黄芩的干燥根中提取纯化的黄酮类化合物,既往研究表明黄芩素在包括NSCLC的多种细胞中具有抗肿瘤作用。此外,黄芩素还可通过不同途径影响多种癌细胞的顺铂敏感性,其中包括MAPK途径,NF-κB途径等。PTEN(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten),即人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因,位于10q23.3,是已知的一种常见的肿瘤抑癌基因,既往有研究报道PTEN可参与调控黄芩素在胃癌细胞对5-氟尿嘧啶的耐药改善,但PTEN是否参与、以何途径参与黄芩素对非小细胞肺癌的调控机制,目前尚未有学者研究。本课题组的既往研究发现了多种非编码RNA在肺癌调控机制中的参与作用,以及多种中药单体通过miRNA调控通路实现抗肿瘤作用。结合既往研究基础及文献报道,黄芩素也许能通过miRNA/PTEN途径参与肺癌细胞生物学行为的调控,在此方面的研究尚未有报道。本课题旨在研究黄芩素对非小细胞肺癌细胞增殖、凋亡、侵袭、顺铂敏感性等的影响,并对其作用机制进行探讨。本课题内容主要分为两个部分:第一部分,检测不同浓度的黄芩素处理对NSCLC细胞的增殖、凋亡、侵袭及顺铂敏感性等的影响,并通过构建裸鼠移植瘤模型对黄芩素的体内增殖抑制效应进行研究;第二部分,对黄芩素处理的细胞进行miRNA基因微阵列分析,筛选出差异性表达的miRNA,通过miRNA数据库预测其靶基因,对黄芩素在NSCLC细胞中的调控机制进行探索和验证。第一部分 黄岑素对非小细胞肺癌细胞增殖、凋亡、侵袭及顺铂敏感性的影响方法1.乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)实验和 cell counting kit-8(CCK-8)实验检测不同浓度黄芩素(0,20,40,60,80,100 μM)处理24 h的正常支气管上皮细胞NHBE、肺上皮细胞BEAS-2B和四种NSCLC细胞的光密度(optical density,OD)值,代表对细胞的毒性作用。2.CCK-8实验检测0,40 μM黄芩素处理的NSCLC细胞在0,24 h,48 h,72 h时的OD值,代表细胞的增殖能力,并绘制生长曲线。3.1%琼脂糖包被的96孔板模拟3D细胞培养环境,CCK-8实验检测0,40 μM黄芩素处理的NSCLC细胞48 h时的OD值,计算细胞相对活性。4.10 d平板克隆形成实验检测0,40 μM黄芩素对NSCLC细胞的克隆形成数的影响。5.AnnexinV-FITC/PI双标流式细胞术和Caspase3/7活性检测实验检测0,40,80 μM黄芩素处理48 h对NSCLC细胞的凋亡能力的影响。6.应用8.0 μm的Transwell小室和包被Matrigel的Transwell小室,分别检测0,40,80 μM黄芩素对NSCLC细胞的迁移和侵袭能力的影响。7.在0,20,40 μM黄芩素作用下的NSCLC细胞和A549/DDP细胞,分别给予不同浓度顺铂(0,2,4,8,16,32 μM)处理,CCK-8实验检测24 h后各组细胞的OD值,计算增殖抑制率和每组细胞顺铂的IC50值。8.含GFP荧光标签的A549细胞以1×107/mL的密度接种0.2 mL至裸鼠腋下,成功构建裸鼠移植瘤模型后分别给予腹腔注射生理盐水(每天0.2 mL,持续3周)、黄岑素(3mg/Kg,每天1次,持续3周)、顺铂(3mg/Kg,每周2次,持续3周)、或黄芩素联合顺铂的四种不同干预处理;应用小动物活体成像仪每周观察裸鼠移植瘤的荧光信号,每周测量裸鼠体重,免疫组化检测各组瘤组织Ki-67染色阳性率。9.采用IBM SPSS Statistics 21.0软件进行数据的统计学分析,利用GraphPad Prism 5软件进行绘图及部分统计学分析;两组样本计量资料的比较采用t检验,三组及以上计量资料采用单因素方差分析,组内比较采用LSD或Bonferroni检验;不符合正态分布或方差齐性的数据采用非参数检验;检验水准 α=0.05。结果1.黄芩素处理 24 h 的 NCI-H1299,NCI-H460,NCI-H358 和 A549 四种 NSCLC细胞的细胞毒性随剂量增加而逐渐增强(P<0.05);BEAS-2B和NHBE细胞的毒性即使在高浓度黄芩素作用下也仅有轻微的毒性作用。2.与对照组相比,40 μM的黄芩素可在24 h后显著抑制A549和NCI-H460细胞的OD值,即抑制细胞的增殖能力(P<0.05);且随时间延长,两组之间的增殖能力差异逐渐显著。3.3D细胞培养条件下,黄芩素处理48 h的A549和NCI-H460细胞的细胞活性较对照组亦明显下降(P<0.05)。4.与对照组相比,40 μM的黄芩素组NSCLC细胞的克隆形成数明显降低(P<0.05)。5.黄芩素处理48 h后的A549和NCI-H460细胞的凋亡细胞数和caspase3/7活性呈浓度依赖性的升高(P<0.05)。6.黄芩素能降低A549和NCI-H460细胞的迁移和侵袭实验的跨膜细胞数(P<0.05),组内比较显示80 μM黄芩素较40 μM黄芩素的跨膜细胞数更低(P<0.05)。7.A549细胞,NCI-H460细胞和A549/DDP细胞的顺铂IC50值分别为9.15 μM,5.23 μM和31.35 μM;40 μM黄芩素能降低顺铂在敏感细胞和耐药A549/DDP细胞中的IC50值(P<0.05)。8.裸鼠移植瘤实验结果表明,与对照组相比,黄芩素在体内能降低裸鼠移植瘤的荧光强度及Ki-67阳性率,即抑制其增殖(P<0.05);黄芩素与顺铂的联合用药组较单用顺铂组具有更低的荧光强度及Ki-67阳性率(P<0.05),即黄芩素与顺铂联合应用具有协同抗肿瘤增殖的作用。第二部分黄芩素通过miR-424-3p及其下游通路对非小细胞肺癌细胞的调控机制研究方法1.40 μM黄芩素和0.5%DMSO分别处理A549细胞24 h,提取RNA后进行miRNA微阵列分析以发现差异性表达的miRNA并对检测结果进行RT-qPCR验证。2.应用脂质体2000转染miR-424-3p inhibitor,设立miR-inhibitor组、黄芩素组、对照组,分别采用CCK-8实验、AnnexinV-FITC/PI双标流式细胞术和Caspase3/7活性检测、Transwell实验,对比40 μM黄芩素处理与下调miR-424-3p对NSCLC细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭能力的影响;CCK-8实验检测不同浓度顺铂作用下三组细胞的OD值,计算IC50值。3.通过 Targetscan、microRNAorg、PITA 3 个数据库对 miR-424-3p 的靶基因进行预测,构建靶基因的野生型和突变型双荧光素酶报告基因载体,分别与miR-424-3p mimic或无关序列Scramble共转染,应用双报告基因试剂盒检测24h后各组细胞的荧光素酶活性变化。4.分别在 NSCLC 细胞中转染 miR-424-3p mimic 和 miR-424-3p inhibitor,48 h后应用western blot方法检测靶基因PTEN的蛋白表达水平。5.RT-qPCR方法检测肺癌化疗敏感和耐药的人肺癌组织中miR-424-3p和PTEN mRNA的相对表达水平,并分析其相关性。6.Western blot 检测 0,40,80 μM黄芩素处理对 PTEN、survivin、Bcl-xL、PI3K、pAKT和tAKT蛋白表达水平的影响。7.应用脂质体2000转染miR-424-3p mimic和si-PTEN,分别采用CCK-8实验、AnnexinV-FITC/PI双标流式细胞术和Caspase3/7活性检测、Transwell实验,对比NSCLC细胞中上调miR-424-3p和下调PTEN对黄芩素增殖抑制、促凋亡、侵袭抑制和顺铂增敏作用的回复作用。8.采用IBM SPSS Statistics 21.0软件进行统计学分析;两组独立样本计量资料的比较采用t检验,三组及以上计量资料采用单因素方差分析,组内比较采用LSD或Bonferroni检验;相关性分析采用Pearson相关分析;不符合正态分布或方差齐性的数据采用非参数检验;检验水准α=0.05。结果1.黄芩素处理后A549细胞的miRNA芯片结果显示,发现了 33个差异性表达的miRNA,其中24个表达下调,下调倍数在2.3-5.5倍;9个上调,上调倍数在2.0-2.6倍。在下调的miRNA中,miR-424-3p与对照组的表达差异最为显著;RT-qPCR检测结果显示黄芩素处理后的miR-424-3p在NSCLC细胞中表达水平下调(P<0.05)。2.与对照组相比,40 μM黄芩素处理和下调miR-424-3p在NSCLC细胞中具有类似的作用,均可降低CCK-8实验中NSCLC细胞的OD值(P<0.05),升高凋亡实验中的凋亡细胞数及caspase3/7比值(P<0.05),降低Transwell实验中迁移和侵袭实验的跨膜细胞数(P<0.05),及降低顺铂的IC50值(P<0.05)。3.靶基因预测分析发现PTEN mRNA 3’UTR区与miR-424-3p存在互补配对区域;PTEN的野生型和突变型双报告基因载体成功构建,双报告基因实验结果表明,只有WT+miR-424-3P组的相对荧光素酶活性下降,与其他三组的差异有统计学意义(P<0.05)。说明miR-424-3p可通过作用于其与WT_PTEN片段的互补配对区域导致荧光素酶基因活性下降。4.miR-424-3p组的PTEN的相对表达水平较Blank组降低(P<0.05);miR-inhibitor 组 PTEN 的表达水平较 Blank 组升高(P<0.05),表明 miR-424-3p可负向调控PTEN蛋白的表达水平。5.肺癌组织中化疗敏感组miR-424-3p表达水平低于耐药组,而PTEN mRNA相对表达水平则高于耐药组(P<0.05);miR-424-3p与PTEN mRNA相对表达水平具有相关性(r=-0.546,P<0.05)。6.40 μM和80μM黄芩素均上调了 A549和NCI-H460细胞中PTEN蛋白的相对表达水平,下调了 PI3K、p-AKT的相对表达水平(P<0.05);同时,40 μM和80 μM黄芩素降低了 A549和NCI-H460细胞中凋亡抑制蛋白survivin和Bcl-xL 的表达水平(P<0.05);且在 NCI-H460 细胞中,survivin 和 Bcl-xL的表达水平随黄芩素浓度升高而降低(P<0.05)。7.在NSCLC细胞中上调miR-424-3p或下调PTEN表达,可回复黄芩素的增殖抑制、促凋亡、顺铂增敏作用,与黄芩素单独应用组相比差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论1.黄芩素可抑制非小细胞肺癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力,促进其凋亡,并增加其对顺铂的敏感性。2.本研究发现黄芩素可下调miR-424-3p的相对表达水平,下调凋亡抑制蛋白survivin 和Bcl-xL的表达,并通过miR-424-3p/PTEN/PI3K/AKT途径调控非小细胞肺癌细胞的生物学行为,为黄芩素的临床应用前景提供了理论和实验依据。