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近年来随着人们对防御素生物活性研究的深入,其在机体免疫系统中发挥的功能也逐渐显露,防御素的免疫活性作用更引起广泛的关注,用防御素作为新型免疫增强剂以提高动物体免疫功能的研究已成为新的热点。
本实验将鸡β—防御素AvBD1成熟肽基因克隆并连接到真核载体pcDNA3.1(+)上,成功构建了pcDNA3.1(+)—AvBD1真核表达质粒。通过脂质体转染法转入Vero细胞内,经体外培养后,获得重组蛋白AvBD1,所得蛋白大小为4.1KD。对该蛋白进行体外抗菌试验,结果表明对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌及沙门氏菌等都具有很好的抗菌效果。
另本实验将β—防御素AvBD1基因与IBDV的VP2基因串联起来,构建了串联质粒pcDNA3.1(+)—AvBD1—VP2,同时构建了pcDNA3.1(+)—VP2质粒。用去内毒素质粒大量抽提试剂盒获得大量高纯度的无内毒素真核质粒,并用这些质粒作为DNA疫苗进行动物免疫试验。试验分为七组,每组10只鸡,包括pcDNA3.1(+)—AvBD1—VP2组,pcDNA3.1(+)—VP2组,pcDNA3.1(+)—AvBD1组,AvBD1蛋白组,IBDV弱毒苗组,pcDNA3.1(+)空质粒组,PBS对照组。于14日龄时首免,首免后第15d进行加强免疫一次。首免后7d、14d、21d、28d、35d对免疫鸡只进行颈静脉采血,分离血清,采用间接ELISA法检测血清VP2特异性抗体水平;同时分离淋巴细胞,用流式细胞技术分析CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞的百分含量变化。首免后35d,对所有实验动物进行攻毒,观察其免疫保护作用。结果表明pcDNA3.1(+)—AvBD1—VP2、pcDNA3.1(+)—VP2、pcDNA3.1(+)—AvBD1在动物体内均能刺激免疫应答反应,产生抗IBDV VP2的特异性抗体及刺激淋巴细胞的增殖,其中pcDNA3.1(+)—AvBD1—VP2组的免疫效果最为理想。本研究从血清抗体水平、淋巴细胞分析及攻毒保护等多个方面来分析AvBD1的免疫反应活性,推断出鸡β—防御素1可以介导机体的免疫应答反应,并增强机体特异性免疫反应。
综上研究,AvBD1真核质粒构建为深入研究鸡防御素的功能及开发应用找到新的方向,防御素与病毒基因串联的DNA疫苗在生产中的应用将省去传统的DNA疫苗需额外添加佐剂的麻烦,既提高效率又降低成本。