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目的:1.检测Smac在上皮性卵巢癌耐药细胞SKOV3/DDP及其亲本细胞SKOV3中的表达差异。2.构建含成熟Smac片段的真核表达载体pcDNA3.1(+)/Smac,转染上皮性卵巢癌耐药细胞SKOV3/DDP。3.观察转染外源性Smac基因对上皮性卵巢癌耐药细胞的影响。4.初步探讨Smac与卵巢癌耐药的关系。方法:1.MTT法分别检测上皮性卵巢癌耐药细胞SKOV3/DDP和亲本细胞SKOV3的IC50,计算耐药指数。2.采用RT-PCR、Western blot方法分别从基因和蛋白水平检测卵巢癌细胞系SKOV3及其耐药细胞系SKOV3/DDP中Smac/DIABLO的表达水平的差异。3.通过两步法RT-PCR获得成熟Smac的双链cDNA。限制性内切酶XhoI/BamHI对Smac双链cDNA和质粒pcDNA3.1(+)进行双酶切,将纯化回收的DNA和质粒的目的片断用T4DNA连接酶连接,转化大肠杆菌XL1-blue感受态,进行质粒的扩增和测序。4.采用脂质体转染法将pcDNA3.1(+)/Smac真核表达载体导入卵巢癌顺铂耐药细胞系SKOV3/DDP。运用western blot法检测转染前后细胞内Smac表达的变化,MTT法检测Smac表达增加后,细胞在顺铂作用下生存率的改变。应用Annexin-v染色经流式细胞术检测观察Smac基因对卵巢癌细胞凋亡的影响。结果:1.SKOV3/DDP的耐药指数为3.96,可进行耐药实验。2.SKOV3、SKOV3/DDP细胞系中均表达Smac/DIABLO,且SKOV3中Smac的相对含量高于SKOV3/DDP。3.成功构建携带成熟Smac功能片段的真核表达载体。经测序鉴定,符合GeneBank公布的序列。4.Western blot检测转染后耐药细胞Smac蛋白表达增加。MTT结果随顺铂作用浓度及时间的增加,细胞增值抑制率出现明显增加,差异有统计学意义(P＜0.05)。Annexin-v检测转染前、后的耐药细胞,转染Smac的耐药细胞凋亡率升高,差异具有统计学意义(P＜0.05)。结论:蛋白Smac的功能检测表明,Smac在体外培养的卵巢癌耐药细胞中表达降低,其表达的上调与卵巢癌细胞顺铂耐药间存在明确的相关性。体外培养的卵巢癌细胞中增加Smac功能片段表达水平,能够在一定程度上减低卵巢癌细胞对顺铂的耐药性。提示Smac蛋白表达改变可能与卵巢癌细胞耐药相关。