论文部分内容阅读
德氏乳杆菌保加利亚亚种和乳酸亚种是发酵乳制品生产中的常用菌种,但目前尚未明确这两个亚种的基因组、碳水化合物利用能力、发酵特性与功能特性方面的差异性。因此,本论文聚焦于探讨德氏乳杆菌保加利亚亚种和乳酸亚种的基因组特征、牛乳体系的发酵特性和发酵乳的血压调节功能,以期为挖掘相应菌株资源、筛选发酵菌株提供理论与应用参考。本论文基于75株德氏乳杆菌基因组构建了同源基因系统发育树,对不同亚种的糖苷水解酶家族基因和蛋白水解系统相关基因进行了预测,解析了保加利亚亚种和乳酸亚种的基因组功能特征,评价了保加利亚亚种和乳酸亚种对19种碳水化合物的利用能力。选取保加利亚亚种和乳酸亚种代表菌株,从生长产酸特性、挥发性风味物质、非挥发物质和发酵乳多肽组成等方面进行了比较研究,并对发酵乳乳清的体外血管紧张素Ⅰ转换酶（AngiotensinⅠconverting enzyme,ACE）抑制活性和体内血压调节功能进行探讨。对75株德氏乳杆菌基因组进行比较基因组分析,根据系统进化发育树对德氏乳杆菌进行了亚种划分,对糖苷水解酶家族基因的预测结果表明,德氏乳杆菌的不同亚种在糖苷水解酶基因家族的分布上存在明显的亚种差异性。与保加利亚亚种相比,乳酸亚种拥有更多植物源碳水化合物水解的糖苷水解酶基因,其中乳酸亚种ND02、YNF-5、UB0003、D2M49、D10M169和D11M188拥有独特的α-半乳糖苷酶基因。乳蛋白水解系统关键基因预测的结果显示,德氏乳杆菌在乳蛋白水解系统关键基因的分布上没有显示出明显的亚种差异性,而在胞壁蛋白酶（Cell-envelope proteinase,CEP）氨基酸序列中则呈现了显著的亚种或亚群差异性。CEP氨基酸序列构建的系统发育进化树表明,保加利亚亚种CEP的系统进化位置独立分布于其他亚种的CEP;对CEP氨基酸序列与底物特异结合的位点222比对结果表明,乳酸亚种D11M188等6株菌与保加利亚亚种的氨基酸残基都为苏氨酸,而剩余12株乳酸亚种和其余4个德氏乳杆菌亚种都为丙氨酸。德氏乳杆菌保加利亚亚种的CEP定义为Prt B,乳酸亚种D11M188等6株菌的为Prt L-1,其余乳酸亚种的为Prt L-2。功能基因分类注释显示乳酸亚种由于在乳源进化的时间较短,还保留有较强的碳水化合物转运与代谢、转录和适应环境进化与压力应激相关的能力;而保加利亚亚种已经适应了乳体系的进化压力。对保加利亚亚种和乳酸亚种在牛乳体系下的发酵特性进行解析,碳水化合物利用实验结果表明,乳酸亚种能利用的碳水化合物种类多于保加利亚亚种。脱脂乳发酵实验结果显示,保加利亚亚种和乳酸亚种发酵乳的挥发性风味物质具有亚种分布属性,其中2,3-丁二酮和2-戊酮是亚种间的主要差异物质,前者主要存在于乳酸亚种中,而后者主要存在于保加利亚亚种。发酵后期比发酵前期的物质代谢差异更为显著,差异通路主要与碳水化合物和脂肪酸代谢相关。保加利亚亚种和乳酸亚种发酵乳的多肽组成具有亚种差异性,而乳酸亚种内的发酵乳多肽组成差异不显著。在αs2-酪蛋白的水解方面,保加利亚亚种对区域（69–86）和（95–115）具有较强的水解能力,而乳酸亚种则更偏好于对区域（142–172）和（186–207）的水解。对β-酪蛋白的水解方面,保加利亚亚种相比于乳酸亚种具有更为广泛的水解作用。消化后的多肽组学显示β-酪蛋白区域（73–97）和（124–163）为抗消化区域,且是生物活性肽的主要来源区域。对保加利亚亚种和乳酸亚种发酵乳多肽组成的特性进行分析,发现保加利亚亚种DQHXNS8L6的12 h发酵乳经过消化后具有较多的肽段、抗消化肽和ACE抑制肽,乳酸亚种D11M188的12 h发酵乳仅具有较多的ACE抑制肽。同时,保加利亚亚种DQHXNS8L6的24 h发酵乳具有较高的降压二肽Tyr-Pro（YP）含量,且在消化前后都拥有较高的ACE抑制活性,乳酸亚种D11M188的24 h发酵乳仅在消化前具有较高的ACE抑制活性。采用自发性高血压大鼠（Spontaneous hypertension rat,SHR）对保加利亚亚种和乳酸亚种发酵乳乳清进行血压调节功能评价,单次灌胃实验结果表明4株德氏乳杆菌中仅有保加利亚亚种DQHXNS8L6的24 h发酵乳乳清具有血压调节效果;长期灌胃实验结果显示,保加利亚亚种DQHXNS8L6的24 h发酵乳乳清能在4周内能有效缓解SHR的血压升高,第5周开始具有血压调节降压效果。指标的测定结果表明德氏乳杆菌保加利亚亚种DQHXNS8L6发酵乳乳清血压调节的机制可能与其富含的肽段YP有关,在体内通过降低机体氧化应激水平、抑制ACE基因转录水平和蛋白的表达水平、改善主动脉的纤维化和血管壁增厚,最终达到血压调节的效果。