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在传统的基因敲除方案中，同源重组法通常用来可以敲除一个或多个外显子。这种基因敲除方法有几个缺点，如需要胚胎干细胞、载体构建复杂、耗时且花费大、敲除片段通常较短。近年来利用锌指核酸内切酶(ZFN)、转录激活样效应因子(TALEN)和成簇间断短回文重复序列及其相关内切酶(CRISPR/Cas9)进行基因敲除，通常是利用非同源末端连接造成的移码突变使编码基因移码而失活。在哺乳动物基因组中，约80％的序列是非编码的，这些非编码的基因也被证明有重要功能。对于这些非编码基因，有时移码突变或者部分外显子的缺失并不能有效使其功能失活，只有大片段的切除基因序列才能达到敲除目的。在本研究中，我们基于CRISPR/Cas9技术建立了大片段敲除非编码基因的方法。我们首先利用Cas9蛋白在试管内验证了其切割效率，并优化了反应条件。在Cas9蛋白和sgRNA足量的情况下，用单条或2条sgRNA同时切割pEGFP-N1质粒，效率几乎都达到了稳定表达mCherry-P2A-EGFP的293T细胞系作为报告系统，来检测CRISPR/Cas9系统在人细胞中敲除外源序列的效率。结果显示同时转染针对mCherry表达区两端的2条或4条sgRNA，可以在基因组中有效敲除整段mCherry基因。利用同样的实验策略，我们成功构建了长链非编码RNA基因Sox2ot大片段敲除的体外培养的小鼠胚胎干细胞，敲除片段长度约2.4kb。片段缺失的小鼠ES细胞中Sox2ot表达显著降低，其增殖和分化也同时受到了影响。最后，利用小鼠受精卵显微注射，我们成功得到了长链非编码RNA基因Rian敲除的小鼠，敲除片段长达23kb，敲除效率达到33.3％，并且突变可被遗传到子代。利用CRISPR/Cas9技术，我们成功的在体外和体内实现了长片段的基因敲除，并利用此技术构建了长链非编码RNA基因敲除的ES细胞系和小鼠模型。这种技术今后可广泛应用于分子克隆、基因打靶细胞系构建、基因打靶动物模型构建以及相关的其他实际应用中。