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本文对泛素连接酶RNF6在乳腺癌中的功能和作用机制进行了研究。本研究分为三个部分： 第一部分：RNF6在乳腺癌中的表达及临床意义。 目的：RNF6是一种具有环指结构的泛素连接酶，目前对RNF6的研究还比较少。本部分内容探讨了RNF6的表达水平与乳腺癌临床分期、淋巴结数目、激素受体、分子亚型及患者年龄等预后指标之间的关系，旨在探讨环指蛋白RNF6在乳腺癌中的病理学和临床意义。 方法：⑴利用RT-PCR筛查 RNF6在不同癌细胞株中的表达谱；再进一步通过Immunoblotting技术检测RNF6在4种乳腺癌细胞株（MCF7、MDA-231、MDA-435和T47D）中的蛋白表达水平；⑵实时定量PCR（qRT-PCR）检测32例新鲜乳腺癌组织（5例导管内癌、27例浸润性导管癌）和配对癌旁乳腺组织中RNF6的mRNA水平，并分析组间表达差异；利用Immunoblotting技术检测代表性患者中乳腺癌组织和配对癌旁组织中RNF6的蛋白表达情况；⑶利用组织芯片检测143例甲醛固定石蜡包埋的乳腺癌和配对癌旁乳腺组织标本中RNF6的蛋白表达水平，并分析比较其在乳腺癌组织中的表达与临床病理之间的联系。 结果：①RT-PCR筛查发现，RNF6在乳腺癌、肺癌、前列腺癌、急性白血病、多发性骨髓瘤等细胞株中呈高表达水平；Immunoblotting检测发现，与正常癌旁组织样本相比，RNF6在乳腺癌细胞株和乳腺癌组织中蛋白水平表达较高；②32对乳腺癌病人的癌组织和配对癌旁组织中，癌组织中的RNF6 mRNA表达水平显著升高；③在143例乳腺癌病人的癌组织中，RNF6表达水平较癌旁组织明显升高（P<0.05）；且RNF6在浸润性导管癌中的表达与患者年龄、临床分期、ER、PR表达状态相关（P<0.05），而与患者的淋巴结转移、组织病理学分级和HER2的表达状态无显著相关性。 结论：RNF6在乳腺癌细胞株及病人组织中均存在高表达，同时在浸润性导管癌中，RNF6的表达与患者年龄、临床分期、ER、PR蛋白表达状态相关（P<0.05），而与淋巴结转移、组织病理学分级以及HER2的表达状态无显著相关性。以上这些结果表明，RNF6可能与乳腺癌的发生发展密切相关。 第二部分：RNF6对乳腺癌细胞增殖、迁移和耐药性的影响。 目的：RNF6在乳腺癌中高表达，但是其病理意义还不清楚。本部分重点研究RNF6对乳腺癌细胞增殖、迁移和耐药性的影响。 方法：⑴通过生长曲线和划痕实验检测RNF6对乳腺癌细胞增殖及迁移能力的影响；利用shRNA干扰技术检测RNF6沉默对乳腺癌细胞增殖的影响；⑵利用MTT法检测药物5AHQ对乳腺癌细胞MCF7的细胞毒活性；同时利用Immunoblotting技术检测5AHQ对乳腺癌细胞株中RNF6蛋白表达水平的影响；⑶利用MTT法检测药物阿霉素（DOX）对乳腺癌细胞MCF7的细胞毒活性；并利用Immunoblotting技术检测DOX对乳腺癌细胞中RNF6蛋白表达水平及凋亡蛋白PARP表达水平的影响。 结果：①过表达RNF6能够显著促进乳腺癌细胞生长和迁移；沉默RNF6能够明显抑制乳腺癌细胞的生长；②5AHQ能够显著抑制乳腺癌细胞的存活；并抑制RNF6的蛋白表达，呈现时间、浓度依赖性；③DOX能够显著抑制乳腺癌细胞的存活；并抑制RNF6的蛋白表达，呈现时间、浓度依赖性；DOX可能通过凋亡途径来发挥抗肿瘤作用；④过表达RNF6可降低乳腺癌细胞对5AHQ的敏感度。 结论：过表达RNF6能促进乳腺癌细胞的增殖和迁移，而5AHQ和DOX可以下调RNF6的蛋白表达水平，并促进细胞凋亡、抑制乳腺癌细胞的存活；RNF6高表达能增强乳腺癌细胞MCF7对5AHQ的耐药性，推测RNF6可能与肿瘤的耐药性机制相关。 第三部分：RNF6通过ERα/BCL-xL轴促进乳腺癌细胞生存。 目的：已有文献报道，RNF6作为E3泛素连接酶可以介导雄激素受体AR发生非典型泛素化而增强AR的转录因子活性，从而促进前列腺癌细胞生长。而在第一部分的病理学分析中发现，RNF6在乳腺癌中与ER的高表达呈正相关，但其机制尚不清楚。因此，本部分将研究RNF6是否能够影响乳腺癌细胞中雌激素受体ERα的相关功能，从而进一步阐述RNF6在乳腺癌发生发展中的作用。 方法：⑴利用Immunoblotting技术检测 RNF6和 ERα在乳腺癌细胞株 MCF7和MCF7/ADR中的蛋白表达，并检测Bim和Bcl-xL的蛋白水平；⑵通过质粒共转染实验，研究RNF6对ERα蛋白表达的影响；⑶CHX chase实验，研究RNF6对ERα蛋白半衰期的影响；⑷通过质粒共转染实验，研究ERα对Bcl-xL蛋白表达的影响。 结果：①Immunoblotting检测显示，在耐阿霉素的乳腺癌细胞株MCF7/ADR中，RNF6、ERα、Bcl-xL的表达呈现一致性升高，而抗癌蛋白Bim呈下降趋势，表明耐药性的发生可能与肿瘤细胞的抗凋亡有关；②RNF6能够上调外源性和内源性ERα蛋白水平；③通过CHX chase实验发现，RNF6能够延长ERα蛋白的半衰期，增强ERα的蛋白稳定性；④过表达ERα能够上调抗凋亡蛋白Bcl-xL的表达水平。 结论：分析了RNF6在乳腺癌细胞株和病人样本中的表达情况，发现RNF6存在高表达。并通过分析RNF6的表达与136例浸润性导管癌临床病理参数之间的关系发现，RNF6的表达与年龄、临床分期、以及ERα、PR的蛋白表达状态有关。另外，通过基因过表达和基因沉默分析发现，RNF6能够促进乳腺癌细胞的增殖，降低对5AHQ、DOX的敏感性，并影响细胞凋亡。以上这些结果表明，RNF6可能参与了乳腺癌的发生发展及耐药性，其机制可能与抗凋亡有关。