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内嗅皮层(entorhinal cortex,EC)是连接海马和新皮层的重要“门户”,在空间认知过程中起着关键作用。解剖学上,内嗅皮层可以分为内侧内嗅皮层(medial entorhinal cortex)和外侧内嗅皮层(lateral entorhinal cortex),而前者又包括浅层(superficial layers of medial entorhinal cortex,s MEC)和深层(deep layers of medial entorhinal cortex)。对于空间信息的编码,s MEC一方面含有表征特定空间坐标的“网格细胞”(grid cell)和“边界细胞”(border cell),另一方面通过同步化的theta和gamma振荡的方式将空间信息从s MEC向海马输入。在对二维空间环境的探索过程中,s MEC一部分兴奋性神经元的发放集中分布在局部theta节律振荡的特定相位,称为神经元放电的“theta相位锁定(theta phase-locking)”。与之类似,局部gamma振荡(40–100Hz)的能量在特定theta相位亦规律性地出现最大值,即所谓的“theta–gamma耦合(theta–gamma coupling)”。空间认知功能的发挥依赖于良好睡眠-觉醒状态的调节。觉醒状态的维持是由脑内一系列促觉醒系统共同活动的结果。组胺能系统是脑内最重要的促觉醒系统之一,它由局限于后下丘脑结节乳头体核(tuberomammillary nucles,TMN)的一群神经元及其发出的纤维投射,以及广泛分布的组胺受体所组成。褪黑素是重要的促睡眠因子,它由脑内松果体分泌。褪黑素的水平具有明显的昼夜节律性,光照期低而黑暗期高。本课题组前期在离体脑片上的实验结果表明,组胺通过突触后的1型受体(Histamine receptor 1,H1Rs)和突触前的3型受体(Histamine receptor 3,H3Rs)特异性地调控s MEC神经元的兴奋性。然而,在体情况下促觉醒的组胺能系统与促睡眠的褪黑素如何调节s MEC神经元的活动、信息编码以及这种调控作用与空间探索行为的关系目前尚不清楚。因此,本课题采用在体多通道记录、神经药理学、免疫荧光等技术首先对在体情况下组胺与褪黑素对s MEC电活动的效应进行对比,然后观察了组胺能系统对s MEC信息编码及空间探索行为的调控。主要结果如下:1.在体情况下,组胺通过H1Rs增加s MEC神经元兴奋性而褪黑素由3型受体介导抑制其兴奋性。自由活动状态下,在大鼠s MEC注射不同浓度(30μM,300μM,3 m M)的组胺均引起主要投射神经元放电频率的增加(Paired t test,all P<0.001,n30μM=190,n300μM=194,n3 m M=153),并且组胺的兴奋效应具有浓度依赖性(Chi-square test,P<0.001)。为明确组胺产生兴奋效应的受体机制,我们分别在大鼠s MEC给予三种组胺受体阻断剂。结果发现,H1R阻断剂triprolidine(10μM)使s MEC主要投射神经元的放电频率明显降低(Paired t test,P<0.001,n=192),而注射H2R阻断剂ranitidine(100μM)或H3R阻断剂clobenpropit(10μM)均不影响其放电(Paired t test,two comparisons P>0.05,nranitidine=189,nclobenpropit=196)。同样,在triprolidine存在的情况下,组胺(3 m M)对s MEC主要投射神经元的兴奋效应被抑制(Paired t test,P<0.001,n=65),而ranitidine或clobenpropit均无法阻断组胺在s MEC引起的放电频率增加(Paired t test,two comparisons P>0.05,nranitidine=59,nclobenpropit=54)。此外,在体情况下促睡眠的褪黑素对s MEC主要投射神经元的放电具有明显的抑制效应,并且这种效应呈现浓度依赖性(Chi-square test,P<0.001,nvehicle=61,n0.5 m M=57,n1.5 m M=42,n3 m M=49)。给予褪黑素1、2型受体阻断剂luzindole(0.5 m M)并不影响主要投射神经元的放电频率(Paired t test,P>0.05,n=46),而3型受体阻断剂prazosin(1.5 m M)使其放电明显增加(Paired t test,P>0.05,n=51),提示在体情况下褪黑素通过3型受体介导可抑制主要投射神经元的兴奋性。2.H1Rs和H3Rs参与组胺增强s MEC theta和high gamma振荡的能量Theta和gamma振荡是内嗅皮层-海马环路信息编码过程中的重要表征。通过分析s MEC局部场电位(Local field potential,LFP)不同频率带(delta:0.5–4 Hz;theta:4–12 Hz;beta:12–25 Hz;low gamma:25–48 Hz;high gamma:60–120 Hz)的振荡,我们发现较低浓度的组胺(30μM)增强了s MEC中high gamma的能量而降低了delta的能量(Paired t test,Pdelta<0.01,Ptheta>0.05,Plow gamma>0.05,Phigh gamma<0.001,n=11)。300μM和3m M的组胺均引起theta和high gamma能量的显著增加,同时伴随delta能量的减少(Paired t-test,300μM:Pdelta<0.001,Ptheta<0.01,Plow gamma>0.05,Phigh gamma<0.001,n=11;3 m M:Pdelta<0.001,Ptheta<0.001,Phigh gamma<0.001,n=11)。LFP主要反映了局部神经元膜振荡和突触后电位的活动,为明确参与组胺调控LFP振荡的受体机制,我们在s MEC分别注射了三种组胺受体阻断剂。H1R阻断剂(Triprolidine,10μM)和H3R阻断剂(Clobenpropit,10μM)均显著降低了theta和high gamma的能量,同时增强了delta的能量(Paired t-test,triprolidine,Pdelta<0.001,Ptheta<0.001,Pbeta<0.01,Plow gamma<0.05,Phigh gamma<0.001,n=11;Clobenpropit,Pdelta<0.001,Ptheta<0.001,Phigh gamma<0.001,n=11),而H2R阻断剂(Raniditine,100μM)对s MEC LFP不同频率的振荡并无显著影响(Paired t-test,all comparisons P>0.05,n=11)。3.组胺不影响网格细胞和边界细胞的编码明确了在体情况下组胺能系统对s MEC神经元电活动的影响之后,我们进一步观察了组胺是否参与调控空间探索过程中s MEC两种典型空间相关神经元(即网格细胞和边界细胞)的编码。对于所记录到的网格细胞,我们计算了其网格分数(gridness score)、平均发放频率(average rate)、峰值发放频率(peak rate)、信息率(information rate)、松散度(sparsity)、平均发放野大小(mean field size)。结果发现,给予组胺(300μM,3 m M)并不影响其在线编码(Paired t-test,all comparisons P>0.05,n300μM=13,n3 m M=17)。同样,局部注射H1R阻断剂triprolidine(10μM)、H2R阻断剂ranitidine(100μM)或H3R阻断剂clobenpropit(10μM)均未改变网格细胞的编码模式(Paired t-test,all comparisons P>0.05,ntriprolidine=14,nranitidine=16,nclobenpropit=15)。对于所记录到的边界细胞,组胺(300μM)和H1R阻断剂triprolidine(10μM)均未影响其边界得分(Borderness score;paired t-test,P>0.05,nhistamine=14,ntriprolidine=13)。4.组胺增强s MEC主要投射神经元放电的theta相位锁定和LFP的theta–high gamma耦合既然组胺不影响s MEC网格细胞和边界细胞的编码,我们探讨了其是否参与调控theta对主要投射神经元放电和局部gamma振荡的调制。与对照组相比,组胺(3m M)明显增强了s MEC主要投射神经元theta相位锁定的强度(Paired t-test,P<0.001,n=112),而不影响其theta锁定的最佳相位(Paired t-test,P>0.05,n=112)。在s MEC给予H1R阻断剂triprolidine(10μM)后,主要投射神经元的theta相位锁定强度显著降低(Paired t-test,P<0.001,n=119),而锁定的最佳相位无明显改变(Paired t-test,P>0.05,n=119),表明H1Rs参与组胺介导的强化效应。H2R和H3R阻断剂均不影响s MEC主要投射神经元放电的theta相位锁定(Paired t-test,all comparisons P>0.05,nranitidine=136,nclobenpropit=142)。为进一步明确组胺增强s MEC主要投射神经元放电时theta相位锁定的受体机制,我们预先给予不同组胺受体阻断剂再观察其效应。结果发现,在H1R阻断剂triptolidine(10μM)存在的情况下,组胺的增强效应被抑制(Paired t-test,P>0.05,n=129),而H2R阻断剂ranitidine(100μM)和H3R阻断剂clobenpropit(10μM)均不能抑制其效应(Paired t-test,all comparisons P<0.001,nranitidine+histamine=101,nclobenpropit+histamine=99)。由于在体情况下组胺使s MEC局部theta和gamma振荡的能量均增加,我们推测其可能对theta相位和gamma幅度之间的耦合亦发挥调节作用。有趣的是,组胺增强了theta振荡对high gamma幅度的调制(Paired t-test,P<0.001,n=11),而不影响theta–low gamma的耦合强度(Paired t-test,P>0.05,n=11)。在s MEC注射H1R阻断剂triprolidine(10μM)或H3R阻断剂clobenpropit(10μM)均引起theta–high gamma的调制指数(Modulatory index)显著降低(Paired t-test,Ptriprolidine<0.001,ntriprolidine=11;Pclobenpropit<0.05,ntriprolidine=11),提示H1Rs和H3Rs均参与了组胺在s MEC调节局部theta–high gamma耦合。局部给予H2R阻断剂ranitidine(100μM)并不影响theta对high gamma的调制(Paired t-test,P>0.05,n=11)。5.组胺能系统在s MEC参与调节空间识别行为在明确组胺对s MEC信息编码效应的基础上,本课题进一步探索组胺在s MEC相关空间识别行为中的作用。我们采用两种类似的行为范式(单试次识别任务和物体识别任务)以检测大鼠在空间识别任务中的行为学表现。结果发现,H1R阻断剂triprolidine(10μM)使大鼠对改变空间位置的物体进行“再探索”的分数(Re-exploration score)显著降低,而H2R阻断剂ranitidine(100μM)和H3R阻断剂clobenpropit(10μM)均不影响其“再探索”分数(One trial recognition task:two-way repeated-measures of ANOVA,group effect,F3,47=3.756,P<0.001,n=6;Object recognition task:one way ANOVA,P<0.05,n=6)。有趣的是,抑制s MEC组胺能系统后大鼠对新物体识别的行为并未受损(One way ANOVA,all comparisons P>0.05,n=6)。为确定s MEC神经元参与组胺能系统对空间识别的调控,我们对s MEC神经元的c-fos蛋白进行染色。对改变位置的物体进行空间探索后,大鼠s MEC神经元c-fos表达明显增加。预先给予H1R阻断剂triprolidine(10μM)明显抑制了s MEC神经元c-fos的表达,且在训练大鼠对变换位置的物体空间探索后c-fos表达并不增加。H2R阻断剂ranitidine(100μM)和H3R阻断剂clobenpropit(10μM)均无法抑制在训练大鼠探索新的空间位置后s MEC c-fos表达的增加(One way ANOVA,P<0.001,n=9)。6.组胺增强s MEC神经元放电的theta相位锁定和theta–high gamma耦合与空间识别行为相关如前已述,空间探索过程中,组胺增强了s MEC主要投射神经元放电的theta相位锁定和LFP的theta–high gamma耦合,并且组胺能系统在空间识别过程中起作用。那么,组胺对s MEC电活动的调控与行为之间是否具有相互关系呢?我们进一步分析了大鼠空间识别训练过程中s MEC电活动的变化。结果发现,在探索新的空间位置时s MEC主要投射神经元放电的theta相位锁定强度明显增加(Paired t-test,all comparisions P<0.001,nobject exploration task=62,none trial recognition task=59)。H1R阻断剂triprolidine(10μM)使其theta相位锁定强度显著降低,并抑制了空间识别过程中锁定强度的增加(Paired t-test,all comparisons P>0.05,nobject exploration task=85;none trial recognition task=53)。与之类似,在对新的空间位置的物体探索过程中s MEC局部theta–high gamma的耦合强度显著增加(Two-way repeated measures of ANOVA,object exploration task,P<0.001;one-trial recognition task,P<0.05,n=6)。H1R阻断剂triprolidine(10μM)抑制了s MEC theta–high gamma耦合,以及空间探索过程中调制指数的增加(Two-way repeated measures of ANOVA,P>0.05,n=6)。有趣的是,H3R阻断剂clobenpropit(10μM)尽管抑制了基础状态下s MEC中theta–high gamma的耦合,但并不能阻断大鼠识别新的空间位置时调制指数的增加(Two-way repeated measures of ANOVA,P<0.001,n=6)。综上,本研究发现,在体情况下组胺通过H1Rs增加s MEC主要投射神经元的放电;H1Rs和H3Rs介导组胺增强s MEC局部theta和high gamma能量的效应;空间探索过程中,组胺并不影响网格细胞和边界细胞的编码,但强化了主要投射神经元放电的theta相位锁定和LFP的theta–high gamma耦合;组胺能系统增强theta对s MEC主要投射神经元放电和high gamma的调制与其对空间识别行为的调控具有紧密相关性。