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自然杀伤细胞(natural killer cells, NK cells)是天然免疫系统的一个重要组成部分,在机体抵抗病毒感染和抗肿瘤的过程中发挥关键作用,不需要预先的致敏便能杀伤发生恶性转化和感染的细胞,而不损伤正常细胞。主要分布于脾脏、骨髓、淋巴结和外周血等处,可在各种趋化因子的诱导下,向炎症等部位迁移。NK细胞表面存在多种抑制型和激活型的受体,各种信号通过这些受体的传递,实现NK细胞的抑制或激活。NK-92细胞是从一个非霍奇金淋巴瘤患者体内分离建立的一种NK细胞系,容易在体外进行大规模的扩增,克服了NK细胞分离和培养的诸多不便,被广泛地应用于免疫治疗研究。NKG2D是一个多亚基的细胞表面受体复合物,属于C型凝集素样受体家族中的一员,表达于αβCD8 T细胞、γδT细胞和NK细胞等免疫细胞的表面,是NK细胞的一种重要的激活型受体,能与多种不同的配体分子相作用而激活NK细胞。主要组织相容性复合体I类相关分子A(Major Histocompatibility Complex class I related Chain A,MICA)是NKG2D的主要配体,由383个氨基酸组成,具有3个胞外结构域(α1、α2和α3)、一个跨膜结构域和一个胞质尾区。在正常情况下,只在成纤维细胞、胃肠上皮细胞和内皮细胞等处表达,但在多种肿瘤细胞表面均存在表达上调的现象,NK细胞对这类细胞具有更高的杀伤活性。Herceptin是获美国FDA许可的用于治疗Her-2过表达乳腺癌患者的一种重组的人源化单克隆抗体,能特异地与靶细胞表面的Her-2受体相结合,抑制Her-2过表达肿瘤的生长,通过与化疗治疗的联合用药,虽取得了一定的疗效,但治愈率低,仍待进一步的改进。为获得更好的抗肿瘤效果,本研究欲整合Herceptin靶向地结合作用于Her-2阳性肿瘤细胞和MICA特异地活化NK细胞的功能,构建具有双重功能的Herceptin与MICA的融合蛋白,通过融合蛋白的抗体部分与Her-2阳性的肿瘤细胞相结合,再通过MICA部分与NK细胞结合,在增强NK细胞杀伤活性的同时,还能使NK细胞更多地聚集在靶细胞的周围,对靶细胞进行更有效地杀伤。本文先是通过Overlap-PCR的方法构建了Herceptin全长抗体基因与MICA的胞外结构域部分基因的融合基因——Herceptin-MICA(E),再将该融合基因重组进一5型腺病毒,并用该重组腺病毒感染293细胞而获得所需的融合蛋白,通过ELISA和Western blot的方法检测融合蛋白在上清中的表达情况,并用间接免疫荧光分析(Indirect immunofluorescence Assay,IFA)检测蛋白与细胞表面Her-2受体的结合特性,最后用乳酸脱氢酶释放实验,研究该融合蛋白对于NK细胞杀伤SK-OV-3细胞(一种Her-2阳性的卵巢癌细胞株)的影响。结果发现,重组腺病毒Ad5-Herceptin-MICA(E)在体外能够顺利表达预期大小分子量的融合蛋白Herceptin-MICA(E),同时,在感染48h后的细胞上清中,其表达量为(471.93±12.33)ng/ml;经Herceptin-MICA(E)处理的SK-OV-3细胞能在荧光显微镜下观察到绿色荧光,其荧光强度与商品化的Herceptin的相似;细胞毒活性实验(乳酸脱氢酶释放实验)发现,在不同效靶比的实验处理组中(1:1、3:1、10:1和30:1),与未做处理的对照组及经Herceptin处理实验组的SK-OV-3细胞相比,NK-92细胞对预先用Herceptin-MICA(E)处理过的SK-OV-3细胞的杀伤率出现了明显的升高,而对于对照组和Herceptin处理组的SK-OV-3细胞的杀伤不存在显著差异。