黄瓜挥发性化合物的合成及调控的分子机制研究

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在自然界植物能够合成多种多样的挥发性有机化合物,这些挥发性有机化合物在吸引昆虫授粉、种子传播、植物抗植食性动物、抗病原菌及对人类的营养健康等方面发挥重要作用。黄瓜(Cucumis sativus L.)是一种广泛种植的重要的经济栽培蔬菜,但人们对于黄瓜挥发性化合物在植物-环境互作中的生理功能尚不清楚,为了解决这一问题,明确黄瓜挥发性化合物的生物合成及调控的分子机制显得尤为重要。  本研究利用气相色谱-质谱联用仪建立了一套稳定且可重复的黄瓜挥发性化合物测定方法。利用该方法我们完成了不同组织、不同发育时期下的23个样品的挥发性有机化合物的定性和定量分析。我们共检测到85个挥发性化合物信号,其中24个信号的化合物结构是经过标准品的比对鉴定。结果表明黄瓜不同组织的挥发性化合物多为醛酮醇的类型,其中萜类化合物的种类最多,达36种,包含21种单萜类化合物和15种倍半萜类化合物。仅次于萜类化合物,有27种的醛醇化合物(中短链),有8种苯丙素类/苯环类的化合物,有4种类胡萝卜素降解物和10种其它类型的化合物。主成分分析和组织聚类分析都表明黄瓜挥发性化合物的含量分布呈现出组织特异性:芳香族醛醇类化合物在黄瓜的根及花中特异性的积累,壬醛类化合物主要是在果实中积累,而己醛类物质则主要在叶子中积累。黄瓜挥发性化合物呈现出的组织特异性为我们利用基因-代谢物关联分析的方法鉴定参与其生物学过程的候选基因奠定了基础。为深入研究黄瓜挥发性化合物生物合成的分子机制,我们利用RNA-seq技术同步获取了23个样本对应的转录组信息。数据分析表明我们总共检测到约269百万条reads数,平均每个组织12.6百万条reads数。其中有253百万条高质量的reads数(94.04%)能够比对黄瓜的基因组,在比对上黄瓜基因组上的reads数中,有87.87%的reads数是唯一比对到基因组上的,剩余的12.52%的reads数比对到基因组多个位点上。进一步的分析显示绝大多数的比对上基因组的reads是在外显子部分,只有不到1/5的reads在内含子部分及少量在非基因区域部分,测序总深度达到了1891x。最终,我们共获得21788个Unigenes的组织表达信息(即至少在一个组织中检测到其基因表达)。利用基因组水平的基因表达-挥发物关联分析的方法,我们构建了黄瓜挥发性化合物的代谢网络。通过该代谢网络,我们系统性研究和阐明黄瓜挥发性化合物的生物合成通路和调控的分子机制,预测了一些可能参与重要挥发性化合物的生物合成及调控的候选基因,同时我们也通过数据分析调查了不同组织的特异表达基因,暗示这些基因可能参与了对应组织化合物的生物合成通路(当然不仅仅局限于挥发性化合物)。为了验证关联分析预测候选基因的准确性,我们利用原核表达、蛋白纯化和体外酶活鉴定等技术手段对黄瓜挥发性萜类物质生物合成途径进行了详尽解析。结果表明:在黄瓜成株根中的单萜生物合成可能由CsaTPS11(Csa2G299920基因编码)负责,CsaTPS14(Csa3G039850基因编码)则负责根中倍半萜的生物合成,而黄瓜果实中倍半萜的生物合成则可能由CsaTPS15(Csa3G040850基因编码)负责,除此之外,黄瓜花中的芳樟醇的生物合成可能由CsaTPS01(Csa1G066550基因编码)负责。我们体外生化试验结果也证明了黄瓜异源GGPPS酶(CsaGGPPS1(Csa2G296070基因编码)和CsaSSUI(Csa7G211090基因编码))可能参与了黄瓜成株根中单萜的合成,为单萜生物合成途径提供底物-GPP。通过基因和基因之间的关联分析,我们又进一步确定了可能参与黄瓜成株根中单萜化合物氧化过程的P450候选基因,为下一步实验验证提供了重要线索。
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