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研究背景 URI（Unconventional prefoldin RPB5 Interactor）是进化上保守的前折叠素家族成员之一，是RNA聚合酶II亚型5作用蛋白，介入营养敏感的mTOR依赖的转录程序的调节。多项研究表明URI是一个癌基因。我们前期实验表明URI可促进胃癌MGC-803、HGC-27细胞的存活和迁移，增强对化疗药物的耐药性。自噬是一个吞噬本身损伤细胞器和蛋白，经过溶酶体参与的降解，保持营养循环的代谢进程。肿瘤中自噬的生物学意义非常复杂，即便在同一种肿瘤研究中也会得出不同结论。但普遍的认识是自噬在肿瘤的发生、发展、耐药和靶向治疗中可能有重要意义，靶向自噬治疗肿瘤的实验研究展示了临床应用的前景。有研究发现PI3K/Akt/mTOR通路蛋白过表达对胃癌的预后具有潜在意义。由于URI是mTOR通路相关分子，我们推测URI参与了自噬的调节。本文将探索URI对胃癌MGC-803和HGC-27细胞自噬的调控及其机制。 研究目的 探究URI是否参与胃癌细胞自噬的调节及其机制。 研究方法 （1）胃癌细胞培养 本研究中我们用低分化的MGC-803胃癌细胞和未分化的HGC-27胃癌细胞作为研究对象。两种细胞分别培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基和RPMI-1640培养基。 （2）URI的过表达和敲低 通过分别转染pCMV6-URI质粒和URI siRNA-A干扰片段建立URI过表达的和敲低表达的胃癌MGC-803和HGC-27细胞株。用荧光定量PCR法和免疫印迹法检测胃癌细胞MGC-803和HGC-27中URI的mRNA表达水平和蛋白表达水平，验证干预效果。 （3）胃癌细胞自噬检测 转染GFP-LC3，激光共聚焦显微镜观察细胞胞浆中明亮的绿色荧光斑点，评估LC3蛋白的定位和转化；用透射电镜察看细胞自噬泡形态状况；在联合使用NH4Cl抑制溶酶体与自噬小体融合的情况下，通过免疫印迹法分析LC3-II/LC3-I比值改变，评估胃癌细胞的自噬流水平。 （4）Western blot法检测mTOR、p70S6K磷酸化水平 在干预URI表达的情况下通过western blot法检测mTOR、p70S6K和磷酸化mTOR、磷酸化p70S6K1表达水平，探索URI调控胃癌细胞自噬的机制。 研究结果 （1）干预URI表达的胃癌细胞株构建 转染pCMV6-URI质粒的胃癌细胞中URI表达量显著升高，转染URI siRNA-A沉默片段的胃癌细胞中URI的表达水平明显下降，表明干扰URI表达的胃癌细胞株构建成功。 （2）URI siRNA-A转染诱导GFP-LC3 转位至自噬体膜 激光共聚焦显微镜观察到敲低URI的胃癌细胞中明亮的绿色荧光斑点增多，但经3-MA，一种自噬早期抑制剂处理后绿色荧光斑点减少，表明随着自噬体形成，GFP-LC3转位至自噬小体的膜上。 （3）URI siRNA-A转染诱导自噬囊泡形成 用透射电镜观察到敲低URI表达的胃癌细胞中自噬囊泡增多。相反，在无关序列转染的细胞和经3-MA处理的siRNA-A转染细胞中自噬囊泡少见。这进一步提示敲低URI表达可以促进胃癌细胞自噬小体的形成。 （4）URI敲低后增强细胞自噬流 通过western blot分析显示，同单纯敲低URI的细胞以及同敲低URI+雷帕霉素处理的细胞相比，在添加溶酶体抑制剂NH4CL处理后上述两种细胞的LC3-II/LC3-I比值显著升高，表明敲低URI表达可促进胃癌细胞的自噬过程，即自噬流是增强的。 （5）URI调节mTOR、p70S6K的磷酸化水平 在MGC-803和HGC-27两株胃癌细胞中，转染过表达质粒URI后，同对照组相比，P-mTOR和P-p70S6K的表达水平增加；敲低URI后，P-mTOR和P-p70S6K的蛋白表达水平减低。 结论 （1）URI敲低诱导MGC-803和HGC-27胃癌细胞的自噬。 （2）URI敲低诱导胃癌细胞自噬的机制可能涉及URI对mTOR/p70S6K通路的调节。