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对虾白斑综合征(WSS)是全球对虾养殖业所面临的危害性最大的病害之一,至今已席卷了世界各国的对虾养殖地区,造成巨大的经济损失。但目前尚无有效的防治手段。因此,如何预防和控制该病毒病一直是近年来研究的热点。本研究在构建wssv重组VP28抗原蛋白枯草芽孢工程菌(B. subtilis-VP28)与卵黄抗体(VP28-IgY)的基础上,经口服途径免疫克氏原螯虾,进行保护螯虾抵抗WSSV感染的效果试验,并初步研究B.subtilis-VP28和VP28-IgY的抗病机理。主要研究内容和结果如下：1新型穿梭分泌性表达载体pBES的构建在多功能穿梭克隆载体pBEC(来源于B.subtilispUB1 10和Ecoli pGEM3载体)的基础上,引入B.subtilis强启动子PEσ43和一段新天然信号肽序列,构建了一新型Bsubtilis-E. coli穿梭分泌性表达载体pBES。为评价所构建载体的表达与分泌效率,引入β-葡聚糖酶报告基因,进行分泌量动态分析。经SDS-PAGE分析及不同时间酶活测定表明,β-葡聚糖酶报告基因成功获得分泌表达,在强启动子PEσ43作用下,其单位发酵液总酶活最高可达283.45 U／ml。然而,胞外酶活最高为116.95 U／ml,分泌比例为41.26%,可见此天然信号肽分泌能力有限,还需作进一步的突变筛选。2 B. subtilis信号肽结构区域氨基酸组成与分泌效率的关系从野生型天然信号肽N区正电荷数与H区疏水性改造的角度出发,构建了一系列(15个)信号肽突变体,研究信号肽结构区域氨基酸组成与信号肽功能的关系。实验结果表明,N区的正电荷有利于提高信号肽分泌能力,但过高的电荷反而使分泌效率有所下降；H区疏水性对分泌效率影响较大,过高或过低的疏水性都不利于分泌识别过程；同时具有N区高正电荷及H区高疏水性的信号肽,反而分泌效率低；在N区高正电荷的情况下,H区中度疏水性的信号肽分泌能力最强。本研究筛出了两条具有高分泌能力的突变信号肽：H3N2 (MRARKIAGM ATSGGVAQPSSAVA)、H3N23 (MRRRKIAGMATSGGVAQPSSAVA),报告基因胞外分泌量分别达到80.28%与80.66%,比亲本天然信号肽均提高1.95倍。本试验成功筛选并构建得到基于强启动子PEσ43与高分泌能力信号肽H3N2、H3N23的枯草芽孢杆菌高效分泌表达载体pBES-H3N2和pBES-H3N23。3 vp28基因的高效分泌表达及分泌动态分析利用构建的Bsubtilis高效分泌表达载体pBES-H3N2和pBES-H3N23,以低蛋白酶活性的B.subtilisWB600作为宿主菌,构建了重组VP28蛋白枯草芽孢工程菌B.subtilis (pBES(H3N2)-VP28)和B. subtilis (pBES(H3N23)-VP28),vp28基因成功获得胞外分泌表达。用兔抗anti-VP28 IgG检测,具有免疫反应性。对分泌效率进行动态分析,结果显示,两株高效表达菌株均在22 h时达到最大VP28蛋白分泌量,分别为45.6 mg／L和47.4 mg／L,22 h之后分泌量略有下降,最后趋于稳定。4特异性VP28-IgY的制备与稳定性研究将表达纯化的WSSV重组VP28抗原蛋白免疫150日龄的海兰白蛋鸡,免疫三次,每隔2周免疫一次。对卵黄中特异性VP28-IgY的抗体效价及其变化规律进行检测。结果显示,在首免后第14天即可检测到特异性抗体(P/N=2.555,1：400)；第56天抗体效价达到最高(P/N=14.920,1：3200)；至120天试验结束时,抗体效价仍维持在较高水平(P/N=9.265,1：1600)。用水稀释法结合50%、33%饱和硫酸铵沉淀提纯IgY的方法,可得到特异性IgY估测纯度约为83.6%。SDS-PAGE分析提纯的IgY,发现重、轻链分别约为60 kDa与25 kDa,估算其总分子量约为170 kDa。对VP28-IgY稳定性研究表明,其在温度低于70℃、pH3.0-10.0范围内有较好的稳定性；对胃蛋白酶和渗透压具有较强的耐受性。5口服工程菌B.subtilis-VP28和VP28-IgY的螯虾体内保护效果制备芽孢期和营养期形式的工程菌Bsubtilis-VP28,并研究口服工程菌的保护效果。结果显示,以芽孢形式免疫组rVP28-bs的螯虾相对存活率均高于营养期形式组rVP28-bv,在免疫后第3、14、28天攻毒,前者相对存活率分别为65.4%、78.3%和59.7%,后者相对存活率分别为38.2%、51.7%和36.8%。为研究口服VP28-IgY中和病毒产生的保护效果,以0.01%、0.05%和0.1%的添加量添加至虾饵料,连续投喂20天后口服攻毒,相对存活率分别为48.3%、86.0%和88.3%。以上结果表明,工程菌Bsubtilis-VP28的芽孢形式,具有较理想的口服免疫效果；而以中和作用为主的VP28-IgY,其保护效果较为理想的最低添加量为0.05%。6B.subtilis-VP28和VP28-IgY抗病性机理初步研究对B.subtilis-VP28保护机理初步研究表明,工程菌Bsubtilis-VP28能特异性降低WSS的发病率,并同时激发螯虾体内非特异性免疫因子及提高抗氧化能力,从而增强虾体对WSSV的抵抗性。根据光镜、电镜观察结果推测,口服VP28-IgY(0.05%添加量)组,在攻毒后初期,螯虾体内大部分病毒被中和,另一小部分病毒侵入血细胞及其它组织细胞,但在未达到致死量或未使组织达到严重损伤时,即逐步被中和清除。Bsubtilis-VP28和VP28-IgY能中和与清除螯虾体内的病毒,并由此抑制或缓解WSSV引发的大量细胞凋亡。