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前言： 阿尔茨海默病(Alzheimers disease，AD)是一种以进行性认知功能障碍和行为损害为特征的中枢神经系统退行性病变，其典型病理改变是β-淀粉样蛋白(amyloid-β,Aβ)沉积形成的老年斑和异常过度磷酸化tau蛋白形成的神经原纤维缠结。其病因和发病机制复杂，涵盖了许多遗传和环境危险因子，成千上万个基因表达的变化，多种致病通道表达上调，如Aβ沉积，tau蛋白过度磷酸化，炎症，氧化应激，能量代谢，异常的细胞周期/凋亡等。此外，除了Aβ诱导的突变外，这些危险分子和遗传因素在致病过程中并未显示绝对的外显率:很多人可能拥有AD最突出的危险因素以及表达过多的Aβ和tau蛋白病理，却未发展成AD。Brickell等对3对同卵双生的FAD患者进行研究，发现即使具有完全相同基因组的两个孪生子，发病年龄、临床症状都不完全相同。遗传学中的一个前沿领域:表观遗传学(Epigenetics)，为人们提供了解答这类问题的新思路。同卵双生的双胞胎对同种病的易感性往往不同，这可能就是表观遗传学机制在起作用。传统观念一般认为基因变异才能影响表型，但越来越多证据表明表观遗传学机制可调控基因参与疾病发生。 过去十几年中，在AD相关基因的异常DNA甲基化方面的研究已经取得了一些进展，但大部分研究只是针对几个或一群基因采取候选基因研究方法，迄今还没有基于全基因组层面上直接、全面、系统分析AD中DNA甲基化情况的报道。缺少高通量筛选技术可能是影响基因组水平研究DNA甲基化的关键因素。DNA甲基化芯片的发展为推动表观遗传组学研究提供了新的契机。NibmbleGen公司制备的甲基化芯片是目前国际上覆盖人类基因组CpG岛最多、注释最全面的一种芯片，而且这种芯片具有较高灵敏度和特异性的特点。 基于以上因素，本课题利用APP/PS双转基因小鼠，采用最新发展的甲基化DNA免疫沉淀(Methylated DNA Immunoprecipitation，MeDIP)结合NimbleGen CpG Promoter芯片高通量分析APP双转基因小鼠皮层脑组织DNA甲基化情况，并结合芯片提供的信息，选取和AD密切相关的异常甲基化基因，利用Mass ARRAY(@)EpiTYPERTM DNA甲基化分析技术进一步进行验证，初步筛选出AD相关的异常甲基化基因。为探讨AD发生发展的表观遗传学机制提供帮助，同时也为寻找AD的诊断、治疗或预后等相关的分子标志物提供依据。 实验方法： 实验选取性别、年龄匹配的APPswe/PSAE9双转基因阿尔茨海默病小鼠模型与正常野生小鼠各3只，提取脑组织基因组DNA，MseI酶切使DNA片段化，并对酶切产物进行纯化，一部分酶切后的DNA样品预留为对照Input样品，另一部分进行免疫共沉淀为IP样品。然后5-甲基胞嘧啶抗体与DNA样品进行孵育，磁珠富集DNA-抗体复合物，蛋白酶K消化复合物，分离DNA片段并纯化。将IP和Input样品进行全基因组扩增并纯化，用Klenow酶进行标记(IP样品标记Cy5+Input样品标记Cy3)，将标记好的IP样品和Input样品进行芯片杂交，最后经芯片扫描仪获取图像，应用相关软件分析获得异常甲基化基因，并在线进行功能分析。芯片扫描获取图像后经Nimble Scan及Signal Map软件分析得到log2-Ratio值，值越大代表该基因的甲基化程度越高，并统计检验P-value，P＜0.05具有统计学意义，作为筛选标准。结合KEGG数据库对异常甲基化基因利用Ingenuity Pathways Analysis(IPA)软件在线功能分析它们可能涉及的生物学过程、作用的通路及分子网络。通过分析挑选5个和AD密切相关的高甲基化基因，利用Mass Array检测系统进行DNA甲基化定量分析，对DNA样品进行亚硫酸盐处理，PCR扩增，碱性磷酸酶处理(SAP)，体外转录(IVT)和RNase酶切，纯化，点样及质谱。 数据分析采用SPSS for windows 11.5统计软件包进行数据处理，采用t检验分析。P＜0.05表示差异有显著性意义。 实验结果： 1、甲基化芯片初步筛选结果 芯片结果经扫描、数据处理初步分析提示，AD组脑组织与对照组脑组织中基因组DNA甲基化存在显著差异。只在AD组脑组织中存在的DNA甲基化片段共有2346个，其中涉及到的基因数485个，这些DNA甲基化片段分布在不同的染色体上。其中，定位在7号染色体上的DNA甲基化片段最多，有263个，占AD脑组织内DNA甲基化片段的11.21％;其次，11号染色体上有228个，占差异总数的9.72％;再者，定位于2、4、1、6和17号染色体上的DNA甲基化片段也比较多，均超过130个以上，分别为160、154、144、139和134个，所占比率分别是6.82％、6.56％、6.14％、5.92％和5.71％，而定位在18号染色体上的差异基因最少，只有44个，所占比率为1.88％，13、12、19、16和X号染色体上的差异基因也较少，所占比率分别为2.47％，2.69％，2.98％，3.11％和3.11％，2346个AD双转基因小鼠脑组织的甲基化区域有2221个(94.6％)位于基因的启动子区，有86个(3.7％)位于基因内部，还有39个(1.7％)则位于基因的上下游，此外2346个甲基化区域有1118个(47.7％)为CpG岛。 筛选出AD双转基因小鼠脑组织的甲基化基因中部分基因具有一定家族聚集性，例如54个嗅觉受体家族基因，43个溶质载体家族基因、18个白细胞介素家族基因、14个角蛋白家族基因、12个细胞色素P450酶系统家族基因在AD双转基因小鼠脑组织中发生甲基化。 此外，芯片还筛选出只在野生小鼠脑组织中发生DNA甲基化的片段共有262个，涉及基因有55个。这些DNA甲基化片段分布在不同的染色体上，其定位和分布数量差别较大，其中，定位在11号和7号染色体上的最多，均为28个，各占野生小鼠脑组织中DNA甲基化片段的10.69％;其次为1号染色体、17号染色体和4号染色体，分别为22个、22个和21个，各占差异总数的8.40％，8.40％，8.02％;定位在X号、12号和16号染色体上的差异基因比较少，分别为4个、3个和3个，各占差异总数的1.53％，1.15％，1.15％;而定位在19号染色体上的差异基因最少，只有2个，所占比率为0.76％。这262个甲基化片段有242个(92.4％)位于基因的启动子区，有12个(4.58％)位于基因内部;有115个(43.9％)为CpG岛。同样，在野生小鼠脑组织中筛选出的甲基化基因也具有一定的家族聚集性。例如，27个嗅觉受体基因发生甲基化。 2、甲基化差异基因的功能分类 AD双转基因小鼠脑组织中甲基化基因功能分析显示差异甲基化基因主要涉及细胞运动、免疫细胞迁移、炎症反应、血液系统发育和功能、细胞信号传导和细胞相互作用、分子运输、细胞组织形态、细胞功能和维护、维生素和矿物质代谢以及神经系统发育等广泛的生物学过程。通路分析显示差异甲基化基因主要参与了机体炎症反应、氧化应激、Aβ的产生和清除、磷脂酶系统、动脉粥样硬化与钙平衡等有关的信号转导通路，如Cell effects of sildenafil(Viagra), IL-12 signaling and production in macrophages,atherosclerosis signaling,heparin sulfate biosynthesis(late stages),neuropathic pain signaling in dorsal hom neurons, hepatic fibrosis/hepatic stellate cell activation, PXR/RXR activation, phospholipases, nitric oxide signaling in the cardiovascular system, LPS/IL-1 mediated inhibition of RXR function, calcium signaling等。分子网络分析显示差异甲基化基因主要涉及的分子网络为： 1.Carbohydrate Metabolism, Molecular Transport, Small Molecule Biochemistry; 2.Cellular Function and Maintenance, Hematological System Development and Function, Cell-To-Cell Signaling and Interaction; 3.Carbohydrate Metabolism, Molecular Transport, Small Molecule Biochemistry; 4.Molecular Transport, Nucleic Acid Metabolism, Small Molecule Biochemistry; 5.Cellular Movement, Immune Cell Trafficking, Hematological System Development and Function等。 野生小鼠脑组织中甲基化基因功能分析显示差异甲基化基因主要涉及细胞功能和维护;细胞运动;细胞生长和增值;细胞凋亡和生存;细胞发育等。通路分析显示差异甲基化基因主要参与了altered T cell and B cell signaling in rheumatoid arthritis; B cell development; TREM1 signaling; Thio-molybdenum cofactor biosynthesis; Alanine degradation Ⅲ等。分子网络分析显示差异甲基化基因主要涉及的分子网络为： 1.Cellular Function and Maintenance, Cell-To-Cell Signaling and Interaction, Hematological System Development and Function 2.Organismal Injury and Abnormalities, Cancer, Gastrointestinal Disease 3.Cancer, Endocrine System Disorders, Gastrointestinal Disease 4.Lipid Metabolism, Molecular Transport, Small Molecule Biochemistry 5.Cellular Movement, Hematological System Development and Function, Immune Cell Trafficking。 3、Sequenom Mass ARRAY(@)Methylation方法初步验证芯片结果 选取SMEK1、ITGA11、PIP4K2A、PTPRE、SFPI15个和AD密切相关的甲基化基因进行验证，经过t检验分析，AD双转基因小鼠脑组织与野生小鼠脑组织中仅PIP4K2A基因的甲基化频率存在明显差异(p＜0.05)。SMEK1、ITGA11、PTPRE、SFPI1基因的甲基化频率无明显差异(p＞0.05)。 结论： 1、采用甲基化DNA免疫共沉淀(MeDIP)结合DNA甲基化芯片技术，系统研究了APP/PS双转基因小鼠及相应正常野生小鼠脑组织中DNA甲基化模式，初步构建了APP/PS双转基因小鼠及相应正常野生小鼠DNA甲基化谱。 2、通过APP/PS双转基因小鼠及相应正常野生小鼠脑组织中DNA甲基化谱的比较分析，提示APP/PS双转基因小鼠与相应的正常野生小鼠脑组织DNA甲基化位点存在明显差异，筛选出APP/PS双转基因小鼠脑组织中DNA甲基化片段2346个，涉及的基因数485个，相应正常野生小鼠脑组织中DNA甲基化片段262个，涉及的基因数55个，初步了解了它们参与的信号转导通路和功能。 3、甲基化芯片作为一种高通量筛选方法，本身可能存在一定的假阴性或假阳性结果。今后更深入的利用甲基化芯片结果进行研究时，还需扩大范围进行筛选和验证。