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体脂性状在猪的育种和生产中占有重要的经济地位,是主要的数量性状和经济指标.神经系统对动物的体脂性状的调控取决于一个多核团和多神经元形成的网络系统.在这些神经元中存在着大量的采食和脂肪代谢通路中的调控因子.现已证明在下丘脑或垂体内含有一定量的能够促进食欲、增加体脂的Agouti相关蛋白(AGRP),抑制食欲、降低体脂的可卡因.安非他明调节转录肽(CART)和阿片黑素促皮质激素原(POMC).三种调控因子与Leptin一样,调节机体的摄食行为和脂肪代谢,缺失或过量表达则可导致肥胖.但目前相关研究主要集中于人类和啮齿类动物,在猪方面未见报道.本研究以猪的CART,AGRP、POMC基因作为候选基因,克隆了其基因序列,并检测其在不同组织和品种中mRNA的丰度.筛查了上述3个候选基因的单核苷酸多态性(SNPs),并通过标记性状连锁分析,研究了部分SNPs与体脂性状的相关.研究结果如下:
1、依据Genbank中注册的猪CART基因的mRNA序列,在Oingene数据库中搜索同源EST,通过电子延伸和RT-PCR方法,首次克隆获得了猪的CART基因的cDNA序列.长度为800 bp,包含完整的CDS,编码117个氨基酸.与人、小鼠和牛的同源性分别为94％、97％和100％.进一步设计引物扩增获得猪的基因组DNA序列,长度为2042 bp.包含3个外显子和2个内含子,成功提交GenBank收录,收录号为EF558128.
2、参照人、鼠POMC基因的基因组结构,根据猪POMC基因的已知cDNA序列,设计特异性引物,首次克隆获得了猪POMC基因的内含子1和内含子2.其中内含子1的序列长度为3417 bp,内含子2的序列长度为2166 bp；与外显子拼接得到POMC的基因组DNA序列,长度为5928 bp,提交GenBank收录,收录号为EU184858.
3、通过BAC文库测序,得到了AGRP基因5端的一段基因组序列,长度为209bp,提交GenBank收录,收录号为EU184859.
4、通过克隆测序方法,在猪的CART基因中筛查到29个SNPs和4个插入/缺失多态性.29个SNPs中2个在编码区,且为同义突变,22个在内含子,4个在3UTR区域.AGRP基因中筛查到4个SNPs,均在内含子2内.POMC基因的外显子2区域筛查到2个SNPs和2个插入/缺失多态性.
5、在CART基因中选择适用于限制性内切酶分析的5个位点,AGRP基因中选择1个位点,采用PCR-RFLP方法对华南农业大学长白-蓝塘F2代资源家系的个体进行基因型检测,利用标记性状连锁分析方法,研究标记与猪体脂性状的相关.研究结果表明:在猪AGRP基因的A-713位点:基因型CC与CT间在背膘厚的差异显著(p<0.05)；而在板油重的差异极显著(p<0.01)；CT与TT间在大理石纹和后躯瘦肉重的差异极显著(p<0.01).
针对猪的CART基因,在C1-311位点:基因型AB与BB间在背膘厚和板油重的差异显著(P<0.05)；AA与AB间在瘦肉率、板油重和眼肌面积的差异极显著(P<0.01),在肌内脂肪含量和前、后躯体皮脂重差异显著(P<0.05).
在C2-94位点:基因型CC与TT间在背膘厚的差异显著(P<0.05)；CC与CT间在板油重的差异显著(P<0.05)；CT与TT间在前、后躯皮脂重的差异显著(P<0.05).
在C2-719位点:基因型CC与CT间在眼肌面积和瘦肉率的差异显著(P<0.05).CT与TT间在眼肌面积的差异极显著(P<0.01),而CT与TT间在瘦肉率的差异显著(P<0.05).
在C2-302位点:基因型CC与CT间在背膘厚和瘦肉率的差异显著(P<0.05)；CC与TT间在背膘厚和瘦肉率的差异极显著(P<0.01)；而CC与TT间在PH1和前、后躯体皮脂重的差异显著(P<0.05).
在C2-986位点:基因型CT与TT间在前、后躯体皮脂重的差异显著(P<0.05).
以上结果说明:CART和AGRP基因的不同多态位点与猪的肥胖程度呈显著地相关(P<0.05).提示这两个基因可能参与猪体内的脂肪代谢,调节体脂含量,并对猪的体脂性状产生一定的影响.
6、采用适时荧光定量PCR技术,分析检测了CART、AGRP和POMC三种基因在15种组织中的表达量。研究结果表明:三种基因在不同组织中的表达量差异较大(P<0.05).对于CART基因,以下丘脑中的表达量最高(P<0.01),其次是垂体和小脑,在其他组织中的表达量很低.对于AGRP基因,同样是下丘脑中的表达量最高(P<0.01),其次是膀胱和小脑,在其他组织中的表达量非常低.对于POMC基因,以垂体中的表达量最高(P<0.01),在其它组织中的表达量都很低.说明CART和AGRP基因主要分布和表达在下丘脑,POMC基因主要分布和表达在垂体.
7、根据CART、AGRP和POMC在各组织中的分布情况,采用适时荧光定量PCR技术,分析检测了三种基因在瘦肉型猪种(长白)和脂肪型猪种(蓝塘)下丘脑、垂体、小脑中的表达量。研究结果表明:CART基因在瘦肉型猪种(长白)下丘脑内的表达量远远高于脂肪型猪种(蓝塘猪)(P<0.05)；AGRP基因在脂肪型猪种(蓝塘)下丘脑内的表达量远远高于瘦肉型猪种(长白猪)(P<0.05)；POMC基因在瘦肉型猪种(长白)垂体内的表达量远远高于脂肪型猪种(蓝塘猪)(P<0.05).说明三种基因在不同品种间的表达量差异较大.由于瘦肉型猪种(长白)在背膘厚和板油重等性状与脂肪型猪种(蓝塘)存在显著差异(P<0.05),作为采食和体脂含量的调节因子,三种基因在不同品种间表达的差异性说明其可能参与猪体内的脂肪代谢,调节体脂含量,影响猪的肥胖.