肝星状细胞活化对IGFBP2、IGFBP6、IGFBP7（rP1）表达影响的研究

• 作 者: 张骞骞
• 出 处: 山西医科大学
• 发表日期: 2007年01期
• 关键词: 胰岛素样生长因子结合蛋白2 胰岛素样生长因子结合蛋白6 肝星状细胞 转化生长因子β1 胰岛素样生长因子结合蛋白-7(rP1) 转化生长因子-β1 I型胶原

目的:通过观察IGFBP2、IGFBP6在TGFβ₁诱导的肝星状细胞中表达的变化,以探讨IGFBP2、IGFBP6在肝纤维化发生中的作用机制。方法:选择体外培养的大鼠肝星状细胞株（HSC-T6）作为研究对象,分别设立正常对照组（加入等量PBS）及不同浓度的TGFβ₁ 2ng/ml、4ng/ml、8ng/ml、16ng/ml处理组,作用24小时后收集细胞爬片或抽提细胞胞浆蛋白,分别采用免疫细胞化学染色及WesternBlot分析的方法检测IGFBP2、IGFBP6在HSC-T6中表达的水平并将其通过图像分析系统进行分析。结果:1)免疫细胞化学染色结果显示:各组细胞胞浆内均可见棕黄色或棕褐色颗粒沉积,呈IGFBP2、IGFBP6阳性表达。经图像分析显示,TGFβ₁处理2ng/ml（4.22±0.36、5.17±0.41）、4ng/ml（5.42±0.36、5.18±0.32）、8ng/ml（4.94±0.33、4.02±0.33）、16ng/ml（3.99±0.31、3.07±0.32）组IGFBP2、IGFBP6表达均较正常对照组（2.26±0.29、1.99±0.16）显著增强（P＜0.05）,在一定范围内呈剂量依赖关系,其中TGFβ₁ 4ng/ml组IGFBP2、IGFBP6表达最强（P＜0.05）。2)Western Blot分析结果显示:34kD、56kD、43kD处分别代表IGFBP2、6及内参照（β-actin）的位置,TGFβ₁处理2ng/ml、4ng/ml、8ng/ml、16ng/ml组均可见明显的蛋白条带表达,正常对照组IGFBP2未见条带,而IGFBP6可见一条细微的条带,经内参照（β-actin）校正后结果显示,IGFBP2在TGFβ₁处理2ng/ml（0.9901±0.0054）、4ng/ml（1.0335±0.0078）、8ng/ml（0.9847±0.0157）、16ng/ml（0.7465±0.0132）组较正常对照组（0.0331±0.0079）蛋白表达显著增加（P＜0.05）,IGFBP6在TGFβ₁处理2ng/ml（1.0244±0.0171）、4ng/ml（1.0379±0.0151）、组较正常对照组（1.0085±0.0131）蛋白表达显著增加（P＜0.05）,其中TGFβ₁ 4ng/ml组IGFBP2、IGFBP6蛋白表达最强。结论:IGFBP2、IGFBP6在现已公认的最强的致肝纤维化因子TGFβ₁诱导的HSC-T6中表达明显增强,说明IGFBP2、6可能参与了肝纤维化的形成。目的:通过观察IGFBP7（rP1）在TGFβ₁诱导的肝星状细胞中表达的变化及抗IGFBP7（rP1）抗体对TGFβ₁诱导的肝星状细胞产生Ⅰ型胶原（CollagenⅠ）的影响,以探讨IGFBP7（rP1）在肝纤维化发生中的作用机制。方法:选择体外培养的大鼠肝星状细胞株（HSC-T6）作为研究对象,分别设立正常对照组（加入等量PBS）及不同浓度的TGFβ₁ 2ng/ml、4ng/ml、8ng/ml、16ng/ml处理组,作用24小时后收集细胞爬片或抽提细胞胞浆蛋白,分别采用免疫细胞化学染色及WesternBlot分析的方法检测IGFBP7（rP1）在HSC-T6中表达的水平并将其通过图像分析系统进行分析。同时,收集正常对照组及经TGFβ₁ 2ng/ml、4ng/ml、抗IGFBP7（rP1）抗体0.1ug/ml、1ug/ml、2ug/ml及TGFβ₁ 2ng/ml+抗IGFBP7（rP1）抗体0.1ug/ml、TGFβ₁ 2ng/ml+抗IGFBP7（rP1）1ug/ml、TGFβ₁ 2ng/ml+抗IGFBP7（rP1）抗体2ug/ml、TGFβ₁ 4ng/ml+抗IGFBP7（rP1）抗体0.1ug/ml、TGFβ₁ 4ng/ml+抗IGFBP7（rP1）抗体1ug/ml处理HSC-T6 24小时后的细胞培养液上清,采用ELISA法检测细胞培养液上清中CollagenⅠ的含量。结果:1)免疫细胞化学染色结果显示:各组细胞胞浆内均可见棕黄色或棕褐色颗粒沉积,呈IGFBP7（rP1）阳性表达。经图像分析显示,TGFβ₁处理2ng/ml（3.71±0.32）、4ng/ml（6.45±0.33）、8ng/ml（4.91±0.31）、16ng/ml（4.31±0.26）组IGFBP7（rP1）表达均较正常对照组（4.86±0.27）显著增强（P＜0.05）,在一定范围内呈剂量依赖关系,其中TGFβ₁ 4ng/ml组IGFBP7（rP1）表达最强（P＜0.05）。2)Western Blot分析结果显示:31kD、43kD处分别代表IGFBP7（rP1）及内参照（β-actin）的位置,TGFβ₁处理2ng/ml、4ng/ml、8ng/ml、16ng/ml组均可见明显的蛋白条带表达,正常对照组IGFBP7（rP1）未见条带,经内参照（β-actin）校正后结果显示,TGFβ₁处理2ng/ml（1.0464±0.0317）、4ng/ml（1.1575±0.0220）、8ng/ml（1.0060±0.0225）、16ng/ml（1.0585±0.0215）组较正常对照组（0.0288±0.0113）IGFBP7（rP1）蛋白表达显著增加（P＜0.05）,其中TGFβ₁ 4ng/ml组IGFBP7（rP1）蛋白表达最强,与免疫化学染色结果相符。3)ELISA结果显示:TGFβ₁ 2ng/ml组（41.93±2.95）与TGFβ₁ 4ng/ml组（49.44±3.21）CollagenⅠ的含量均较正常对照组（36.61±1.28）有显著性差异（P＜0.05）,TGFβ₁ 4ng/ml组CollagenⅠ上升的水平明显高于TGFβ₁ 2ng/ml组（P＜0.05）:抗IGFBP7（rP1）抗体0.1ug/ml组（35.46±5.80）、1ug/ml组（36.38±2.59）、2ug/ml组（37.26±2.12）与正常对照组（36.61±1.28）比较差异无统计学意义（P＞0.05）;TGFβ₁ 2ng/ml+抗IGFBP7（rP1）抗体0.1ug/ml组（38.24±2.76）、TGFβ₁ 2ng/ml+抗IGFBP7（rP1）抗体1ug/ml组（33.95±3.27）、TGFβ₁ 2ng/ml+抗IGFBP7（rP1）抗体2ug/ml组（34.59±3.97）CollagenⅠ水平与TGFβ₁ 2ng/ml组（41.93±2.95）比较明显降低（P＜0.05）而较正常对照组（36.61±1.28）差异无统计学意义（P＞0.05）,TGFβ₁ 4ng/ml+抗IGFBP7（rP1）抗体0.1ug/m组（40.24±3.46）、TGFβ₁ 4ng/ml+抗IGFBP7（rP1）抗体1ug/ml组（32.61±4.86）CollagenⅠ水平显著低于TGFβ₁ 4ng/ml组（49.44±3.21）（P＜0.05）而与正常对照组（36.61±1.28）相比无统计学意义（P＞0.05）。TGFβ₁ 2ng/ml+抗IGFBP7（rP1）抗体0.1ug/ml组（38.24±2.76）、TGFβ₁ 2ng/ml+抗IGFBP7（rP1）抗体1ug/ml组（33.95±3.27）、TGFβ₁ 2ng/ml+抗IGFBP7（rP1）抗体2ug/ml组（34.59±3.97）组间比较无显著性差异（P＞0.05）,TGFβ₁ 4ng/ml+抗IGFBP7（rP1）抗体0.1ug/ml组（40.24±3.46）与TGFβ₁4ng/ml+抗IGFBP7（rP1）抗体1ug/ml组（32.61±4.86）组间比较差异有显著性（P＜0.05）,其中TGFβ₁ 4ng/ml+抗IGFBP7（rP1）抗体1ug/ml组CollagenⅠ下降水平最为显著。4)相关分析结果显示:TGFβ₁处理的HSC-T6中IGFBP7（rP1）与Collagen呈正相关关系,r值=0.833,P值＜0.01。结论:1、IGFBP7（rP1）在现已公认的最强的致肝纤维化因子TGFβ₁诱导的HSC-T6中表达明显增强。2、TGFβ₁处理的HSC-T6中,IGFBP7（rP1）与CollagenⅠ呈正相关关系。3、抗IGFBP7（rP1）抗体可逆转TGFβ₁诱导的HSC-T6产生的过多的CollagenⅠ。4、IGFBP7（rP1）参与了肝纤维化的形成且在肝纤维化的发生发展中发挥重要作用。