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核糖体失活蛋白(ribosome-inactivating proteins,RIPs)在植物界中广泛存在,其具有RNA N-糖苷酶活性。按照本实验室魏琴博士的方法,把curcin 2的cDNA从麻疯树幼苗叶片的总DNA中分离,编码前成熟蛋白和成熟蛋白的序列(cur2p和cur2m)连接到pMD 18-T(TaKaRa)载体上。通过BamHI和Sac I的双酶切,cur2p和cur2m分别被插入到载体。pBI121(Clontech)中,从而获得两个重组质粒:pBICP和pBICM.通过冻融法,重组质粒pBICP和pBICM被转化到农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株EHA105中。通过叶盘法,我们获得了6株插入了cur2p的转基因植株和9株插入了cur2m的转基因植株。这些植株分别命名为TP1~6和TM1~9。
Curcin 2的表达增强了转基因植株对TMV的抗性。转基因系TP1~6的T1代植株和非转基因植株机械感染TMV病毒后8天,非转基因植株开始表现出系统性感染症状——叶脉透明度开始增加。但是,curcin 2表达量较高的转基因系(TP4,TP5,TP6)的T1代植株16天后仍未表现任何症状,而此时非转基因烟草已经表现出了极其明显的花叶症状——叶脉透明和叶片局部变色。各转基因系烟草开始表现系统性花叶症状的时间随着curcin 2表达量增加而推迟。虽然,所有感染了TMV的烟草植株在一个月后都表现出了花叶症状,但是,我们可以明显看到,转基因植株与非转基因植株相比具有更少的表型缺陷,叶片局部变色很少。对于转基因系TP6的T1代植株生长状况和未感染TMV病毒的烟草没有太大的区别。 Curcin 2的表达增强了转基因植株对立枯丝核菌的抗性。从每个转基因系和非转基因的对照系SR1中各取20株长势较一致的植株,接种真菌后在温室中培养30天。然后,把所有的植株分为5个等级,并分别赋予一个Dl值(0,1,2,3,4),从而可以计算出每个系的Dl平均值。而每个系的感染率用McKinney公式进行计算。每个转基因系的Dl平均值在1.87(line TP3)和1.33(line FP6)之间,所有转基因系的Dl平均值为1.53;而非转基因系的D1平均值是2.12。每个转基因系的感染率在46.8%(line TP3)和33.2%(line TP6)之间,所有转基因系的平均感染率为38.2%;而非转基因系的平均感染率是53.0%。通过比较可以发现,各个系的平均Dl值和感染率都与curcin 2的表达量相关。curcin 2表达量增加,则平均D1值减小,感染率降低。由这些结果我们可以说明,curcin2蛋白在烟草中的积累增强了植株对立枯丝核菌的抗性。