论文部分内容阅读
猪的器官极可能成为人类未来器官的供应源，猪体细胞核移植及转基因的研究虽然取得了一定的进展，但总体来看核移植效率还很低（1％-2％）。印迹基因对动物的生长发育起重要作用，在自然繁殖的动物中，基因印迹是通过配子形成过程中甲基化状态的改变而建立的，而克隆动物未经过配子形成阶段，而是直接将体细胞注入去核的卵中进行发育，这极有可能造成印迹基因的表观遗传修饰异常以及表达异常。本研究拟通过对克隆猪胚胎以及克隆猪个体中印迹基因的表达及甲基化状态进行研究，探索印迹基因的甲基化状态与表达对克隆猪胚胎发育的影响，希望为提高猪体细胞核移植效率提供理论依据。主要研究结果如下：
（1）利用Realtime PCR方法，对四个印迹基因（IGF2、H19、PEG3、GRB10）在存活克隆猪、死亡克隆猪和自然繁殖猪及它们分别对应的胎盘中的表达做了分析，结果表明，四个印迹基因在死亡克隆猪胎盘中的表达水平比存活克隆猪胎盘和自然繁殖猪胎盘低，而存活克隆猪胎盘和自然繁殖猪胎盘之间差异不显著。四个印迹基因在死亡克隆猪、存活克隆猪及自然繁殖猪个体间的表达水平差异不显著。这表明印迹基因在胎盘中的表达异常可能是克隆猪发育失败的重要原因。
（2）利用亚硫酸氢盐修饰后测序方法，对IGF2基因的DMR2和H19基因的CTCF3在存活克隆猪、死亡克隆猪和自然繁殖猪及它们分别对应的胎盘中的甲基化做了分析，结果表明，IGF2和H19基因在死亡克隆猪胎盘中的甲基化水平比存活克隆猪胎盘和自然繁殖猪胎盘高，而存活克隆猪胎盘和自然繁殖猪胎盘之间差异不显著。IGF2和H19基因在死亡克隆猪、存活克隆猪及自然繁殖猪个体间的甲基化水平差异不显著。这表明印迹基因在胎盘中的表达异常可能是由印迹基因甲基化的异常造成的。
（3）利用亚硫酸氢盐修饰后测序方法，对IGF2基因的DMR2和H19基因的CTCF3在植入前核移植胚胎及体外受精胚胎中的甲基化变化做了分析，结果表明，IGF2和H19基因在核移植胚胎中呈现去甲基化趋势，去甲基化主要发生在1-细胞的6-15小时及2-细胞期，且两个印迹基因去甲基化的程度相似，这可能是由核移植过程中重编程的不完全造成的。
（4）利用免疫外科手术法，对体外受精和核移植的囊胚进行了内细胞团和滋养层的分离，通过对内细胞团和滋养层标志性基因的检测，证明我们分离内细胞团和滋养层的方法是正确有效的。
（5）利用亚硫酸氢盐修饰后测序方法，对IGF2基因的DMR2和H19基因的CTCF3在核移植胚胎的内细胞团和滋养层中的甲基化做了分析，结果表明，核移植胚胎内细胞团和滋养层均有不同程度的甲基化异常，内细胞团较滋养层的甲基化趋于正常，这表明印迹基因甲基化正常的细胞优先参与内细胞团的形成，而印迹基因甲基化异常的细胞优先参与滋养层的形成，这可能是胎盘印迹基因异常的原因。
（6）利用BrdU标记的方法，对1-细胞期核移植胚胎DNA复制的时间进行了检测，结果表明，1-细胞期核移植胚胎主要在重构胚激活后6-15小时进行DNA复制，与去甲基化的时间相吻合。这表明印迹基因在核移植胚胎中的去甲基化是由DNA复制过程中维持甲基化的失败造成的。