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流行病学资料表明，2型糖尿病、脂肪肝和心血管疾病等慢性病随着年龄的增长而增加。胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)是这些代谢性疾病的共同病理基础。
本课题观察了老年和高脂环境因素对大鼠骨骼肌和肝脏脂肪酸代谢及AMPK信号通路中关键信号分子表达和活性的影响，探讨老年相关IR的可能机制。研究内容包括以下三部分：
第一部分高脂饮食对老年大鼠骨骼肌和肝脏脂肪酸代谢及胰岛素敏感性的影响
目的: 探讨老年和高脂饮食对大鼠骨骼肌和肝脏脂肪酸代谢的影响及其与IR的相关性，进一步了解老年IR的发病机制。
方法: 22-24月龄雄性Wistar大鼠32只随机分为老年对照组(OC组n=16)、高脂组(HF组，n=16)；4-5月龄大鼠16只作为青年对照组(YC组)。老年对照组和青年对照组给基础饲料，热量组成：碳水化合物65.5％，脂肪10.3％，蛋白质24.2％，总热量为348kcal/100g；高脂组给予高脂饲料，其热量组成：碳水化合物20.1％，脂肪59.8％，蛋白质20.1％，总热量为501kcal/100g。老年两组大鼠每日等热量投喂饲料，每周称体重1次，喂养8周。第4周末从各组随机选8只大鼠行高胰岛素-正葡萄糖钳夹实验评价IR状态。第8周末各组剩余8只大鼠再次行钳夹实验，实验前抽取血样用于测定血清各项指标；实验结束后颈动脉放血处死动物，立即取出股四头肌和肝脏组织放入液氮中冷冻，然后保存于-70℃低温冰箱。骨骼肌和肝脏甘油三酯经氯仿/甲醇抽提后用全自动生化分析仪测定；骨骼肌长链脂酰CoA用荧光分光光度计测定。
结果:
1. 各组一般项目的比较：与青年对照组比较，老年对照组体重明显增加(P<0.01)，但老年对照组和高脂组之间无差别(P>0.05)。老年对照组空腹血糖、胰岛素和游离脂肪酸高于青年对照组，高脂组这几项指标进一步升高，并且出现血清甘油三酯和总胆固醇水平增高(P<0.05或p<0.01)。
2. 胰岛素敏感性评价：分组喂养至4周及8周末，各组钳夹实验结果均表明老年对照组GIR低于青年对照组，高脂组GIR低于老年对照组(P<0.05或p<0.01)；高脂组8周末GIR低于高脂组4周末(P<0.01)。
3. 老年对照组骨骼肌甘油三酯、长链脂酰CoA和肝脏甘油三酯含量高于青年对照组，高脂组与老年对照组相比进一步升高(P<0.05或p<0.01)。
4. 相关分析表明：在老年两组中，骨骼肌甘油三酯和长链脂酰CoA与GIR呈负相关，与空腹血糖及空腹胰岛素呈正相关，长链脂酰CoA还与游离脂肪酸和总胆固醇呈正相关；肝脏甘油三酯与GIR呈负相关，与空腹血糖呈正相关(P<0.05或P<0.01)。
结论:
1. 老年大鼠骨骼肌和肝脏脂质含量高于青年大鼠，葡萄糖输注率低于青年大鼠，说明老年大鼠更易出现脂质异位堆积和IR。
2. 高脂饮食导致老年大鼠骨骼肌和肝脏脂质积聚更加严重，进一步加重IR。
3. 骨骼肌和肝脏脂质含量与葡萄糖输注率呈负相关，说明骨骼肌和肝脏脂毒性可能参与了增龄和高脂饮食相关IR的发生。
第二部分高脂饮食对老年大鼠骨骼肌和肝脏ACC与MCD表达及活性的影响
目的: 探讨老年和高脂饮食对大鼠骨骼肌和肝脏ACC与MCD表达和活性的影响以及ACC和MCD在组织脂质堆积和IR中的作用。
方法: 动物分组及标本留取同第一部分。ACC活性通过测定P-ACC蛋白表达水平来评价(P-ACC，即ACC的磷酸化状态，代表ACC的非活性形式)。骨骼肌和肝脏ACC、P-ACC蛋白表达用Western-blot方法测定；骨骼肌和肝脏MCD mRNA表达采用实时荧光定量RT-PCR分析技术；MCD活性：通过(NH4)2504沉淀提纯蛋白，MCD活性用光谱法测定。
结果:
1. 老年对照组与青年对照组之间、高脂组与老年对照组之间骨骼肌和肝脏ACC蛋白表达均无明显变化(P>0.05)；老年对照组骨骼肌和肝脏P-ACC蛋白水平均低于青年对照组，高脂组与老年对照组相比进一步降低(P<0.05或P<0.01)。
2. 与青年对照组比较，老年对照组骨骼肌MCD mRNA表达有降低的趋势，但差别无统计学意义(P>0.05)，高脂组比老年对照组下降明显(P<0.05)；老年对照组与青年对照组相比、高脂组与老年对照组比较，肝脏MCD mRNA表达均有降低的趋势，但差别无统计学意义(P>0.05)。
3. 老年对照组骨骼肌MCD活性低于青年对照组，高脂喂养后进一步降低(P<0.05)；老年对照组与青年对照组相比、高脂组与老年对照组比较，肝脏MCD活性均有降低的趋势，但差别无统计学意义(P>0.05)。
4. 相关性分析骨骼肌甘油三酯和长链脂酰CoA均与P-ACC蛋白水平呈负相关、与MCD活性呈负相关，长链脂酰CoA还与MCD表达具有相关性；肝脏甘油三酯与P-ACC蛋白表达呈负相关(P<0.05或P<0.01)。
结论:
1. 与青年大鼠相比，老年大鼠骨骼肌和肝脏ACC活性增高，骨骼肌MCD活性下降。
2. 高脂饮食导致老年大鼠骨骼肌和肝脏ACC活性进一步升高，骨骼肌MCD mRNA表达下降、MCD活性进一步降低。
3. 骨骼肌脂质含量与ACC活性及MCD表达和活性具有相关性；肝脏甘油三酯含量与ACC活性呈正相关。
第三部分高脂饮食对老年大鼠骨骼肌和肝脏AMPKα表达及活性的影响
目的: 探讨老年和高脂饮食对大鼠骨骼肌和肝脏AMPKα表达及活性的影响，进一步揭示老年骨骼肌和肝脏脂质堆积的分子机制。
方法: 动物分组及标本留取同第一部分。AMPKα活性通过测定P-AMPKα蛋白表达水平来评价(P-AMPKα，即磷酸化AMPKα，代表AMPKα的活性形式)。AMPKa1和AMPKa2 mRNA表达采用实时荧光定量RT-PCR分析技术；AMPKa1、AMPKa2和P-AMPKα蛋白表达用Western-blot方法测定；骨骼肌AMP、ATP、肌酸和肌酸磷酸及肝脏AMP、ATP含量用高效液相色谱法测定。
结果:
1. 骨骼肌AMPKa1 mRNA表达在老年对照组与青年对照组之间、高脂组与老年对照组之间比较均无差别(P>0.05)：骨骼肌AMPKα2mRNA表达在老年对照组低于青年对照组，高脂组低于老年对照组(P<0.05)。
2. 骨骼肌AMPKα1蛋白表达在三组之间无明显差别；骨骼肌AMPKα2蛋白表达和P-AMPKα蛋白表达在老年对照组低于青年对照组，高脂组与老年对照组相比进一步下降(P<0.05)。
3. 老年对照组与青年对照组相比、高脂组与老年对照组比较，肝脏AMPKα1的mRNA表达均有降低的趋势，差别无统计学意义(P>0.05)；肝脏AMPKα2 mRNA表达在三组之间亦无差别(P>0.05)。
4. 肝脏AMPKα1和AMPKα2蛋白表达在三组之间无明显差别(P>0.05)；肝脏P-AMPKα蛋白表达在老年对照组低于青年对照组，高脂组与老年对照组相比进一步下降(P<0.05)。
5. 老年两组相关分析发现骨骼肌甘油三酯、长链脂酰CoA和肝脏甘油三酯含量均与P-AMPKα的蛋白表达呈负相关，相关系数分别为-0.644、-0.614和-0.737，P值均小于0.05。6 骨骼肌ATP、AMP在老年对照组与青年对照组之间无明显差别，但高脂组均低于老年对照组(P<0.05或P<0.01)；骨骼肌PCr含量在老年对照组与青年对照组之间、高脂组与老年对照组之间均无明显差别(P>0.05)；骨骼肌Cr在老年对照组低于青年对照组，高脂组低于老年对照组(P<0.01)；AMP/ATP及Cr/PCr比率在老年对照组低于青年对照组，高脂组低于老年对照组(P<0.05)。7肝脏ATP含量在老年对照组与青年对照组之间、高脂组与老年对照组之间均无明显差别；而AMP含量在老年对照组低于青年对照组，高脂组与老年对照组相比进一步降低(P<0.01)。AMP/ATP比率在老年对照组低于青年对照组，高脂组低于老年对照组(P<0.05)。
结论:
1. 老年大鼠骨骼肌AMPKα2表达、AMPKα活性和肝脏AMPKα活性均低于青年大鼠。
2. 高脂饮食导致老年大鼠骨骼肌AMPKα2表达和AMPKa活性进一步下降，肝脏AMPKα活性也明显降低。
3. 增龄和高脂饮食导致AMPKα表达和/或活性的改变可能参与了骨骼肌和肝脏脂质堆积及IR的发生。
4. 老年和高脂环境因素可能通过导致骨骼肌和肝脏细胞能量状态的变化影响了AMPKα的表达和活性。