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研究背景:椎间盘退变性疾病(Disc Degeneration Disease, DDD)已被公认为腰痛的主要原因。越来越多的研究证明,椎间盘退变与多种促炎细胞因子及其代谢产物有关。近年来,大量研究证明,MicroRNA (miRNA)在包括退行性椎间盘疾病在内的大多数疾病的发生发展中具有重要作用。目前研究表明,椎间盘退变和炎症因子之间存在密切联系,但是在炎性通路的角度上分析两者相关性的研究较少,椎间盘退变和炎症因子之间具体的作用过程也不明确。虽然我们了解两者之间存在相关性,但仍未找到靶基因来减轻椎间盘细胞炎症反应,所以大部分此类研究应用性不强,缺乏实际意义。MicroRNA-146a作为一种短小的非编码RNA,是一种反调控因子,通过对基因表达转录后调节参与许多生物学过程,尤其是在炎症反应中扮演了重要的角色。基于以上研究成果,本研究拟通过体内和体外实验,从分子水平来研究探讨MicroRNA-146a在椎间盘退变疾病中的调控机制,寻找MicroRNA-146a与TRAF6/NF-K B信号通路交互作用功能分子,为脊椎退变性病变寻找新的治疗靶标。本研究提出MicroRNA-146a过表达可以通过抑制TRAF6/NF-K B通路减轻椎间盘退变炎症反应的假设,期待通过相应的后期实验证明MicroRNA-146a可作为治疗椎间盘退变的一个新靶点。研究目的:1.研究MicroRNA-146a在椎间盘退变患者体内的表达水平,进一步探讨椎间盘退变与MicroRNA-146a表达水平的关系。2.通过人髓核细胞体外实验,研究分析MicroRNA-146a和TRAF6、NF-κ B的相关性,进一步探讨MicroRNA-146a、炎性通路、椎间盘退变三者之间的关系。材料与方法:1.研究对象选自2013年5月至2014年3月在山东省立医院就诊患者及健康体检人员,分为三组;组一为椎间盘退变患者组,共21例,其中男12例,女9例;年龄18-30岁,平均25. 6岁;组二为其他脊柱疾病患者组,共21例,其中男11例,女10例;年龄18-31岁,平均26. 1岁;组三为对照组,健康体检人群21例。其中男13例,女8例;年龄18-32岁,平均26. 7岁。三组人群在年龄,男女比例等方面均无明显差异,具有可比性(P>0. 05)。实时定量PCR(Quantitive Real-Time PCR, qRT-PCR)比较三组对象外周血单核细胞中MicroRNA-146a水平,ELISA法比较三组对象血清NF-κB、TNF-α和IL-1的水平。将所有得到的结果数据资料输入SPSS 18.0软件来进行统计分析,用均数±标准差( ±s)形式来表示实验数据资料,用成组t检验方法来对组间均数进行比较,如果P<0. 05表示具有统计学差异。2.选择人髓核细胞株(Nucleus Pulposus Cells,NP-CELLS), HNPC4800,放置在DMEM培养基中,并在温育箱中进行培养。载体系统的组成包含了载体成分和包装成分:MicroRNA-146amimic (模拟物)和不含有MicroRNA-146a的空白质粒;包装质粒pHelper 1. 0和pHelper2. 0。这些包装质粒提供了病毒包装所需要的结构蛋白和包膜蛋白。我们将NP细胞根据本实验要求因素的不同,进行相应不同的干预和处理,总共分为以下4组:MicroRNA-146a组给予包含NP MicroRNA-146a siRNA 序列的载体干预;NC (Negative Control, NC)组给予包含不对任何基因产生干扰作用的无意义阴性对照;LPS (Lipopolysaccharide,LPS,脂多糖)组是对siRNA序列的载体干预的细胞进行LPS刺激;BL组是空白细胞组,只在相同的培养条件下观察而不做任何干预处理。将所有实验细胞在处理时均设置3个复孔。转染人髓核细胞(NP cells),测试转染率,经LPS (10μ M)刺激以诱导炎症。qRT-PCR检测MicroRNA-146a在NP cells中的表达水平,用qRT-PCR 和 Western blot 检测 NP cells 中的 TNF-α、TRAF6 和 NF-κ B 的基因和蛋白表达,以及MicroRNA-146a和TNF-α、TRAF6和NF-κ B的相关性。实验重复3次,电脑扫描记录实验结果的X光胶片,BandScan 5.0图像分析软件读取胶片上各蛋白条带的灰度值,内参数为β-actin,我们在本实验中将目的蛋白的相对表达量用目的条带和空白对照条带比值的形式来表示,所有实验数据资料我们均采用SPSS18. 0统计学软件来进行分析处理,本实验中的数据资料均以均数±标准差(X± s)的形式来表示。在本实验中,两组间的比较采用的是两个独立样本t检验方法,多组别间的比较采用的是单因素方差分析(One Way ANOVA)方法,如果P<0. 05表示具有统计学差异。结果:1.三组研究对象的MicroRNA-146a表达水平比较,椎间盘退变患者组的MicroRNA-146a表达为1.092±0.453mol/L,明显低于其他两组(其他脊柱疾病患者组2. 871±1. 265 mol/L,对照组3. 122±2. 132 mol/L),差异有统计学意义(P<0.05)。而对照组和其他脊柱疾病患者组相比,差异没有统计学意义(P>0. 05)。三组研究对象的NF-κ B表达水平比较,椎间盘退变患者组表达为137.52±11.45mg/L,明显高于其他两组(其他脊柱疾病患者组25. 12±10. 36 mol/L,对照组28. 11 ±3. 87 mol/L),差异有统计学意义(P<0. 05),而对照组和其他脊柱疾病患者组相比,差异没有统计学意义(P>0. 05)。三组研究对象的TNF-α表达水平比较,椎间盘退变患者组表达为257. 12±10.43mg/L,明显高于其他两组(其他脊柱疾病患者组127.21±21.37 mol/L,对照组118. 12±7.56 mol/L),差异有统计学意义(P<0. 05),而对照组和其他脊柱疾病患者组相比,差异没有统计学意义(P>0. 05)。而三组的IL-1表达水平相比(椎间盘退变患者组124.27±11.25 mol/L,其他脊柱疾病患者组110. 34±7. 57 mol/L,对照组120. 12±4. 58 mol/L),差异均没有统计学意义(P>0. 05)。以上实验结果显示,椎间盘退变患者组MicroRNA-146a表达量明显低于其他脊柱疾病患者组及对照组,且NF-κ B、TNF-α表达量明显高于其他两组。2.将已经线性化的MicroRNA-146a mimic载体与合成的DNA oligo经过连接及转化,然后将含有NP-siRNA序列的重组质粒抽取出来之后再经过测序,我们实验结果显示重组质粒符合我们对本研究的设计要求。本实验将携带增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP)报告基因的载体MicroRNA-146a mimic进行包装而成为载体颗粒,当感染细胞后而在其中表达EGFP,我们在倒置荧光显微镜下发现其发绿色荧光。然后我们进行相应的的预实验条件筛查后表现为,在6 板中每孔细胞数为1 × 105个,我们观察到细胞融合度在转染时可以达到30%～50%,并且当感染复数(multiplicity of infection,M0I) =50,polybrene 5ug/mL的时候我们可以得到较高的感染效率。将各组细胞的总RNA抽提后,再用2%琼脂糖凝胶、100V恒压电泳进行实验,研究结果表明,本实验中总RNA的完整性均较好,其中RNA显示的3条带亮度分别是28S>18S>5S,如图3。然后我们通过核酸蛋白检测仪进行相应检测,结果表明本实验总的RNA没有发生降解,并且RNA的纯度也满足本研究要求,其实验样本的光密度值 OD260/OD280 在 1. 8～2.0 之间。qRT-PCR 检测 MicroRNA-146a,TRAF6和NF-κ B等基因表达水平结果显示,MicroRNA-146a的低表达和TRAF6、NF-κ B的高表达有明显的相关性。使用Western blot方法来检测分析本研究中各组细胞的蛋白表达水平,本实验将β -actin作为内参,将空白细胞组在相同观察时间点的表达量做为100%,并且利用以下公式来计算各组TRAF6及NF-κ B的相对表达量:TRAF6及NF-κ B的表达率(%)=100%X (干预组表达量/空白组表达量),在研究分析获得的各组细胞TRAF6和NF-K B蛋白表达情况后,我们发现两者之间在LPS组都显示较高蛋白浓度,说明了这两者与MicroRNA-146a的表达呈现相关性,抑制MicroRNA-146a的表达可以上调TRAF6和NF-κ B的表达水平,说明MicroRNA-146a与TRAF6和NF-K B之间呈负相关。MicroRNA-146a过表达可以显著降低LPS刺激的NP细胞促炎性细胞因子的水平,并下调TRAF6和NF-κB的mRNA和蛋白表达水平。结论:1. MicroRNA-146a表达量可能与椎间盘细胞炎症反应相关。2. MicroRNA-146a过表达可能会减轻椎间盘细胞炎症反应。3. TRAF6/NF-K B途径的关键因子、蛋白水平与MicroRNA-146a表达水平呈现相关性。4. MicroRNA-146a通过调控通路上的关键因子、蛋白的表达,可能参与椎间盘细胞炎症反应的调节。5.MicroRNA-146a过表达可以通过抑制TRAF/NF-κ B通路减轻椎间盘退变炎症反应。MicroRNA-146a可作为治疗椎间盘退变一个新的靶点。