论文部分内容阅读
EB病毒是人类报道的第一种与肿瘤发生密切相关的病毒，但由于目前对EB病毒感染、复制及裂解机制了解不够深入，同时因其无法感染啮齿类动物而缺乏合适的动物模型，尚未有有效的特异性药物及疫苗正式上市，这样的现状极大的制约了EB病毒相关恶性疾病的预防及治疗效果，因此，研发针对EB病毒的特异预防性疫苗，对于防治EB病毒相关疾病的发生、降低恶性肿瘤及癌症带来的严重健康危害具有重要意义。但在以往的相关研究中，单独使用EB病毒包膜糖蛋白胞外域或经胞外域融合效应分子作为候选预防性疫苗来提高其免疫原性的设计策略，在临床实验中都未能起到预期的显著效果，因此，通过何种方式，如抗原的设计、免疫佐剂及免疫方式的选用等，来显著提高EB病毒预防性疫苗的免疫保护性与免疫持久性，急需人们进行更为深入的探索。在以往报道中，当来自免疫球蛋白IgG的Fc结构域作为融合蛋白使用时，借助其与相应特异受体结合的免疫刺激效应，以及多聚化后带来的血清半衰期显著延长，可以明显提高融合分子的免疫原性，同时经过大量成熟的临床药物实践，其安全性得到了充分证明。 本工作通过对已有EB病毒序列进行分析，构建了EB病毒包膜糖蛋白gp350胞外域融合鼠源IgG2a-Fc区段的融合蛋白，并通过前期工作搭建了杆状病毒表达纯化平台;随后使用昆虫细胞表达并纯化了gp350-Fc融合蛋白及相应的对照组蛋白，初步的蛋白免疫印迹、斑点免疫印迹及分子筛凝胶层析都表明Fc融合蛋白构象正确，分子量与预期大小相一致;随后的ELISA及SPR实验证实gp350在与Fc融合后与其特异中和抗体及受体间的亲和力未受到显著影响，而其分子量也是野生型单体蛋白的近两倍，也进一步证明其通过Fc结构域形成正确构象的二聚体形式;小鼠模型的免疫学实验表明，gp350-Fc融合蛋白较非融合形式来说，无论是采用腹腔免疫还是鼻腔免疫，均能很好的诱导产生更高水平的特异抗体滴度;而竞争性ELISA、SPR实验及体外感染阻断实验也表明Fc融合蛋白的免疫血清中中和抗体滴度要显著高于对照组野生型单体蛋白的免疫血清;最后，ELISA实验证实Fc融合蛋白相较非融合形式蛋白可以诱导产生更高水平的IgG与IgA滴度。综上，本工作使用Fc融合蛋白作为EB病毒预防性疫苗抗原设计思路获得了显著的免疫保护效果，为研制有效的预防性疫苗提供了进一步的实验证据，对于探索防治EB病毒相关疾病的方法具有重要的理论与社会价值。