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大肠杆菌BL21(DE3)/pET表达系统被分别用于生产重组抗人卵巢癌×抗人CD3单链双特异抗体(AhOC<,x>AhCD3)、重组人可溶性B淋巴细胞刺激因子融合蛋白(Trx-hsBLyS)和重组人甲状旁腺激素融合蛋白(Trx-hPTH)。在各重组蛋白的生产过程中均存在着严重的质粒不稳定问题，使目标蛋白的表达水平和产率受到了不同程度的影响。本文对这三种产品生产过程中的质粒稳定性及相关问题分别进行了研究，主要探索了在菌株改造方面解决这些问题的相关策略。
在AhOCxAhCD3的生产过程中采取了一些策略，试图改善含质粒细胞(P<+>细胞)对于无质粒细胞(P<->细胞)的生长劣势，但这些措施并没有提高诱导前重组质粒的稳定性。应用重组功能缺失(recA<->)的大肠杆菌BLR(DE3)代替BL21(DE3)作为宿主，可以降低重组质粒在细胞中的聚体化水平，显著提高诱导前重组细胞的质粒稳定性。对于Trx-hsBLyS与Trx-hPTH的生产过程，BLR(DE3)的使用同样可以显著提高诱导前重组细胞的质粒稳定性。这表明，pET来源的重组质粒在BL21(DE3)中容易形成聚体，由于质粒聚体化而引起的分配性不稳定是诱导前重组BL21(DE3)菌株质粒不稳定的主要原因。
对于这三种重组蛋白质，在使用BLR(DE3)作为宿主的生产过程中，尽管诱导前可以维持很高的质粒稳定性，但诱导后P<+>细胞的生长均受到严重抑制，随后质粒稳定性迅速降低。虽然目标蛋白的最大表达水平略有提高，但表达水平达到最高值时培养液的细胞密度较低，因此目标蛋白的产率并没有得到提高。
在应用重组BLR(DE3)菌株生产AhOC×AhCD3的过程中，诱导后培养液中的细胞群体具有显著的异质性，其中存在一些能够在含氨苄青霉素和IPTG的LB平板上形成不同大小单菌落的细胞。这些细胞与其祖代细胞形成的培养液诱导后在细胞生长、质粒稳定性以及AhOC×AhCD3表达方面都存在明显的不同。通过在含氨苄青霉素和IPTG的LB平板上挑选一个尺寸很小的单菌落，筛选到了突变的重组BLRM(DE3)菌株。该菌株的应用减弱了诱导后细胞生长受到的抑制，显著提高了诱导后质粒稳定性，最终AhOC×AhCD3的产率接近1.2 g/L，大约是重组BL21(DE3)和BLR(DE3)菌株最高产率的3倍。此外，我们证实是染色体上发生的某些突变赋予了重组BLRM(DE3)菌株不同于重组BLR(DE3)菌株的特征，并且这些特征可以稳定的遗传。应用重组BLRM(DE3)菌株在摇瓶中进行的一阶段培养生产AhOC×AhCD3的工艺在不降低AhOC×AhCD3表达水平及产率的情况下省去了传统两阶段发酵过程中IPTG的添加，从而使发酵过程变的更加简便。该工艺在发酵罐中放大后，最终AhOC×AhCD3产率可以达到2.4g/L左右。将BLRM(DE3)突变宿主分别应用于Trx-hsBLyS和Trx-hPTH的生产，诱导后细胞生长抑制和竞争性质粒不稳定均得到了明显改善，最终目标蛋白产率也由原来的1.5 g/L和0.7 g/L分别提高到了3.5g/L和1g/L。在本论文的工作中，通过BLR(DE3)宿主的应用以及随后的筛选策略，获得了BLRM(DE3)突变宿主。该宿主的应用有效的提高了三种不同重组蛋白产品发酵过程的质粒稳定性以及最终产率。对于其他遇到类似问题的应用BL21(DE3)/pET表达系统的重组蛋白生产过程，本文所提出的菌株改造方法也具有借鉴意义。