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小分子RNA是植物中广泛存在的、长度介于20～30nt之间的单链非编码RNA，它们由第三类核酸酶DICER-like(DCL)负责合成，在植物发育、病毒防御、逆境响应和维持基因组稳定性等方面起着重要的调控作用。水稻作为一种重要的粮食作物及单子叶模式植物，研究和鉴定水稻中小分子RNA的种类及其功能具有重要的价值。
本实验室前期获得了一个在小分子RNA代谢途径上的功能缺失突变体osdcl4-1，研究表明OsDCL4的缺失显著影响了包括tasiRNA在内的21nt siRNA的合成，osdcl4-1表型比其拟南芥中的同源基因dcl4-2显著，说明水稻中的OsDCL4具有更为广泛的生物学功能。为了研究OsDCL4负责合成的小分子RNA的种类及其特征，我们分别对93-11和osdcl4-1的幼苗及幼穗组织共四个材料进行了小分子RNA文库的构建和Solexa大规模测序。通过对各个文库上百万条小分子RNA序列的分析，我们发现osdcl4-1对于幼穗中总的21nt小分子RNA的影响最显著，小分子RNA下调幅度达到63.7％，而幼苗中的下调幅度仅为28.8％，这可能与osDCL4在幼苗时期表达量相对较低有关；此外，osdcl4-1在导致21nt小分RNA下调的同时也致使24nt小分子RNA的相对含量升高。为了研究籼粳稻中小分子RNA的差异，我们还测定了日本晴幼穗的小分子RNA，分析表明基因间区(intergenic)是造成籼粳间小分子RNA差异的主要来源，其中，能在各自基因组中良好匹配的幼穗unique的小分子RNA只有67％能在另外一个基因组中完全匹配，从该分析中我们还获得了146条在两个亚种间表达差异较显著的小分子RNA，为进一步研究杂种优势机制打下基础。
在对已知microRNA的克隆和分析中我们发现水稻microRNA在苗期具有更高的标准化丰度，四个文库中的克隆数据表明93-11幼苗中克隆到60个家族共101条unique microRNA，而93-11幼穗中的克隆数分别为57和85；microRNA的丰度经过标准化后，幼苗中microRNA总的数量是幼穗中的8.3倍。除此以外，我们通过生物信息学的方法还鉴定了10条新的microRNA，其中全新的microRNA有4条，并从中观察到一例新的microRNA多顺反子现象，剩余的6条修正了前人的预测结果，这些新鉴定出来的microRNA大部份都偏向于在苗期表达；并且，个别microRNA的合成由OsDCL4负责，这丰富了我们对于植物中microRNA合成机制的认识。
tasiRNA对于水稻的发育非常重要，因此为了鉴定水稻中除TAS3之外有无其它TAS基因，我们构建了一套用于预测21nt tasiRNA的算法，并从中鉴定出一类内源的、由OsDCL4负责合成的、在幼穗中特异表达的一类新的21nt phased siRNA，由于暂未发现其明显的靶位点，故将其命名为pcsiRNA。在93-11和日本晴幼穗中分别有1140和1543个位点可产生这类pcsiRNA(Pscore＞25)，其数量差异有可能会影响到籼粳亚种间的基因表达调控从而导致不同背景下籼粳osdcl4-1的表型差异。pcsiRNA主要分布在non-TE的基因间区，其中28％左右的位点转录的mRNA的5末端具有一个保守的通过切割起始pcsiRNA cluster形成的motif序列，我们通过Northern blot杂交表明了识别该motif序列的小分子RNA的存在，并且该小分子RNA自身的合成也受到OsDCL4的影响，但不受OsDCL1的影响，含有该motif的mRNA被识别后将在motif的中部切割和起始21nt phased siRNA cluster的形成。并且，除了21nt pcsiRNA，我们还在水稻中首次发现另外一类长度为24nt pcsiRNA的存在，通过野生型和突变体小分子RNA丰度以及Pscore的比较我们推测它们位点的合成数量不受OsDCL4影响；而通过我们的算法并未在拟南芥中找到明显的24nt pcsiRNA(Pscore＞25)。因此，对这类两种长度的pcsiRNA的鉴定丰富了我们对于水稻siRNA的认识。
此外，我们还从水稻基因组中发现两个新的可产生tasiRNA D6(+)的TAS3位点，我们将其命名为TAS3d和TAS3e。通过对幼苗和幼穗中总共五个TAS3所产生tasiRNA D6(+)的小分子RNA的克隆比较，我们推测在幼穗时期表达较低而在幼苗中表达较高的TAS3b对于水稻的背复轴的发育和极性的建立可能起重要调控作用，而其它的TAS3基因所产生的tasiRNA D6(+)在幼苗和幼穗中均较低，并且无明显差异。我们通过5RLM RACE证明了水稻TAS3a含有的两个miR390识别位点主要由3末端的识别位点进行切割起始，而5末端并不产生切割。我们利用5RLM RACE进一步证明了来源于TAS3的tasiRNA D6(+)对于4个ARF基因(Os01g48060，Os01g54990，Os05g43920，Os05g48870)有切割作用，从分子水平提供了tasiRNA在转录水平负调控水稻ARF的直接证据。
总之，通过对两个水稻亚种的小分子RNA测序分析及比较，我们从中获得了一些启示，为水稻小分子RNA介导的表观遗传研究奠定了基础，也为我们下一步的研究指明了方向，具有重要的数据支撑和应用价值。