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背景和目的近几十年来,随着人类生活水平的提高,动脉硬化成为人类死亡的主要原因。在动脉硬化发病机制研究中,不断发现一些与动脉硬化相关的基因,三磷酸腺苷结合盒转运体A1 (ABCA1)是其中主要的一种。ABCA1基因位于9q31,长度149kb,含有50个外显子和49个内含子,编码2261个氨基酸组成的完整跨膜蛋白,分子量为250kD。ABCA1以ATP为能源,促进细胞内游离胆固醇和磷脂的流出,结合到细胞表面的apoA1,形成新生的高密度脂蛋白(HDLC),并启动胆固醇逆转运过程。ABCA1基因突变导致Tangier病(TD)和家族性低α脂蛋白血症(FHA),临床表现为严重的HDL、apoA1低下,早发动脉粥样硬化,伴有肝脾肿大和外周神经病变等。目前国外报道ABCA1基因有81个突变位点,包括54个错义突变,3个剪接突变,20个插入或缺失突变,4个其他类型突变(http://www.hgmd.org),这些突变位点可导致脂质流出障碍,促进动脉硬化的发展。ABCA1基因编码区和非编码区含有大量的SNP位点,研究表明这些SNP位点与血浆脂质水平以及动脉硬化程度有密切的相关性。目前关于ABCA1基因变异在中国汉族人群中研究较罕见,大多是单核甘酸多态性SNP的易感性研究,尚未见中国人群ABCA1基因突变的研究。另一方面ABCA1基因SNP研究主要集中在心血管疾病方面,与脑梗死易感性研究较少见,尤其是多个SNP位点与脑梗死的研究则更罕见。本研究目的在于探讨ABCA1基因在中国汉族人群中的变异分布情况及其SNP与脑梗死的易感性研究;同时对于可疑突变位点进行突变体的功能研究。方法1采用PCR-RFLP、变性聚丙烯酰胺电泳技术及DNA序列测定技术,对72例HDL<0.8 mmol/L及apoA1<0.8 mmol/L的动脉粥样硬化性脑梗死患者的ABCA1基因突变簇部分外显子(外显子7、14、17、19、49)及其内含子交界区进行变异检测;对于新发现的变异位点在200例正常对照中进行验证,并采用Panther软件分析其功能的变化。2采用PCR-RFLP技术,以病例-对照方式研究324例脑梗塞患者(动脉粥样硬化脑梗塞组193例和腔梗组131例)及正常对照152例,对ABCA1基因1051G→A (Arg219Lys)和2826G→A (Val825Ile)多态进行检测,比较不同基因型与个体血脂水平及其与脑梗死的易感性的相关性;比较不同基因型间的协同相互作用。3构建ABCA1-EGFP真核表达质粒的野生型和突变体,进行转染293T细胞,以免疫荧光共聚焦显微镜观察野生型和突变体细胞的ABCA1蛋白的表达情况(形态学变化);另一方面转染293T细胞24小时后,加入含Dehydroergosterol (DHE)细胞培养基,利用高效液相色谱技术(HPLC)检测野生型和突变体细胞对DHE转运的能力。结果中国汉族人群中存在国外已经报道的7号外显子R219K和17外显子V825I两个SNP位点;在动脉粥样硬化性脑梗塞(ACI)组R219K基因型频率和等位基因频率与对照组比较差异有显著性(χ2 = 9.89,P < 0.01;χ2 = 9.16, P<0.005);在年龄大于60岁亚组,ACI组与对照组比较,KK基因型频率和K等位基因频率差异有显著性(χ2 =13.91, P<0.005;χ2=11.46, P<0.005);在男性亚组,ACI组与对照组比较, KK基因型频率和K等位基因频率差异有显著性(χ2=13.24,P<0.005;χ2 =8.60,P<0.005);携带KK基因型的个体较RR携带者罹患动脉粥样硬化性脑梗塞的风险显著减少(OR: 0.30, 95% CI: 0.14～0.66,P =0.002);在高血压患者中,相对于KK基因型,RK和RR基因型者罹患ACI的风险增加(OR: 3.09, 95%CI: 1.54–6.19, P = 0.002; OR: 4.81, 95% CI: 1.94–11.94, P = 0.001);类似的结果亦可见于VI和VV相对于II基因型;相对于KK和II携带者,RR和VI携带者罹患ACI的分险明显增加(OR: 2.69, 95% CI: 1.39–5.22, P = 0.003)。V825I位点与动脉粥样硬化性脑梗塞则无明显关系。相对于RR型,RK、KK基因型血清ApoA1水平呈逐渐增加趋势(P=0.04;P=0.03);在女性患者中相对RR型者,携带K等位基因者血清ApoA1和HDL-C水平更高(P = 0.01)。V825I位点则与血脂水平无明显关系。本研究中未发现国内外文献报道的R230C、M233V(7号外显子)以及N831D (17号外显子)等SNP位点;在49号外显子与内含子交界区发现6645+55G→C变异位点,基因型频率分别为44.07%、40.68%和15.25%,等位基因频率35.59%;同时在49号外显子上发现一例2206位点TAC→GAC的杂合子(Y2206D),该患者血浆HDL水平为0.66 mmol/L,apoA1水平为0.61 mmol/L,同时在200例对照组未发现该变异位点,其出现频率小于1%,支持突变的可能性较大;Panther软件分析Y2206D的SubPSEC:-8.746,Pdeleterlous:0.9968,提示该变异位点具有较强的破坏性作用(http://www.Pantherd.org/tools);细胞形态学研究表明ABCA1蛋白2206突变体在细胞内定位发生改变,ABCA1蛋白多位于细胞内内质网上,不能像野生型那样定位于细胞膜上;HPLC检测发现2206突变体细胞对DHE的转运障碍,细胞内DHE含量比野生型明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。结论中国汉族动脉粥样硬化性脑梗死患者中存在ABCA1基因7号外显子R219K、17外显子V825I和49号外显子与内含子交界处6645+55G→C三个SNP位点;第14号和19号外显子未检测出变异位点,14号和19号外显子可能不是中国汉族人群的突变热区;ABCA1基因R219K可能与中国汉族人群动脉粥样硬化脑梗塞遗传易感性有关,尤其在年龄大于60岁和男性亚组中以及患有高血压患者中219K的保护作用更加显著;49号外显子Y2206D变异位点可能是中国汉族人群的新突变位点,并且与血脂代谢异常关系密切。