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目的： 抑癌基因发生异常是癌症发生的机制之一。人类基因的很多区域发生改变时可导致细胞失控性生长。Sema3F作为肺癌19个候选抑癌基因之一，是Ⅲ型Semaphorin（即神经导向因子，最初作为Neuropilins的配体在神经系统中发挥排斥神经节轴突和调节神经系统发育的作用）家族的一个成员。目前有研究发现，与正常组织相比Sema3F蛋白在肿瘤细胞中的表达普遍存在下调的趋势，并在血管形成以及肿瘤增殖、凋亡、粘附和转移等中起着负向调节作用。此外，诸多体内或者体外实验已经证明，Sema3F的表达水平同样影响到肿瘤的发生发展等过程。以上证据提示Sema3F可能是一种潜在的肿瘤分子标记物。然而，由于其多种受体的参与导致的功能多样性和信号通路的复杂性，导致Sema3F在肿瘤生物学行为方面的研究还存在着诸多争议。因此，深入研究Sema3F在肿瘤生物学行为中的作用和相关信号通路，对于进一步阐明Sema3F作用机制、寻找肿瘤新的治疗靶点将具有重要意义。Sema3F的C末端是其发挥作用的重要结构域，该结构经过弗林蛋白酶(furin)的蛋白水解作用被激活，从而与相应的受体相互作用。基于上述背景，本文旨在通过传统的杂交瘤技术制备一株靶向Sema3F的C末端的单克隆抗体，通过鉴定该抗体的特性并探索该抗体在实际中的应用，从而为开展Sema3F的临床诊断、预测预后以及阐明其在肿瘤细胞中的作用机制提供基础和技术支持。 方法： 利用Sema3F的C末端融合蛋白(Sema3Fc)作为免疫原，免疫4-6周龄雌性Balb/c小鼠，通过细胞融合技术构建可以稳定分泌靶向Sema3F的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。然后扩大培养杂交瘤细胞，注射入Balb/c小鼠腹腔中获得含有Sema3Fc单克隆抗体（Sema3Fc mAb）的腹水。通过rProtein A亲和柱纯化抗体，冻干机冻干抗体;SDS-PAGE电泳分析纯化后的抗体纯度;间接ELISA鉴定腹水中抗体以及纯化冻干后抗体的活性;硫氰酸盐洗脱法测定腹水中抗体的相对亲和指数。然后，采用Western blotting、细胞免疫荧光、流式细胞术、免疫细胞化学染色实验以及免疫组织化学染色实验分别检测制备的单抗与肝癌细胞株和肝癌组织中Sema3F蛋白的结合情况。利用自制的Sema3FcmAb初步建立定量检测Sema3F的竞争ELISA方法，建立标准曲线，分析方法的灵敏度和最低检测限。此外，免疫组织化学染色方法检测肿瘤组织芯片中Sema3F蛋白，分析其在多种肿瘤组织、配对癌旁组织以及不同分期的乳腺癌组织中的表达情况。 结果： 成功获得了2株稳定分泌Sema3Fc mAb的杂交瘤细胞株，分别命名为G5 mAb和E8 mAb。通过腹腔注射杂交瘤细胞得到的腹水经rProteinA亲和柱纯化得到了纯度较高的抗体（抗体纯度约为90％，浓度约为2 mg/mL）;间接ELISA结果表明两株杂交瘤细胞株分泌的Sema3Fc mAb滴度都在1×10-5左右;硫氰酸盐洗脱法表明E8株抗体相对亲和力指数达到了2.5mol/L，具有较高的亲和力。Western blotting结果显示E8 mAb与Sema3Fc融合蛋白及两株肝癌细胞株HepG2、BEL-7402总蛋白中的Sema3F蛋白分别在10KDa、90KDa和120KDa处有一结合条带，说明抗体与线性的Sema3F可以很好的结合，并具有较高的特异性;流式细胞术、细胞免疫荧光和细胞化学染色实验结果表明，单抗与肝癌细胞株中立体结构的Sema3F蛋白也可以很好地结合，并具有很高的特异性;免疫组织化学染色结果表明E8 mAb可以特异性地结合肝癌组织中的Sema3F蛋白。应用自制的抗体通过竞争ELISA方法建立了定量检测Sema3F的标准曲线，得到的回归方程为Y=0.0954x+7.1839，相关系数R2=0.9948。以抑制率达到50％时的竞争物（标准样品）浓度为灵敏度和以抑制率达到10％时的竞争物浓度为最低检测限，分析得到灵敏度和最低检测限分别为448.806ng/mL和29.52ng/mL。组织芯片免疫组化结果显示，Sema3F在多种肿瘤组织及配对癌旁组织中均有不同程度的表达;在不同分期乳腺癌中，Sema3F的表达情况存在着差异。 结论： 1、本实验成功制备筛选出了2株稳定分泌Sema3Fc mAb的杂交瘤细胞株并制备纯化了单克隆抗体。 2、纯化后的G5和E8株单克隆抗体经间接ELISA方法检测，抗体效价均能达到1×10-5，经抗体亚型鉴定，E8株细胞分泌的单抗亚型为IgM。 3、经Western blotting、流式细胞术、细胞免疫荧光、细胞化学染色以及免疫组织化学染色鉴定，E8 mAb能与肝癌细胞株BEL-7402、HepG2以及肝癌组织中Sema3F蛋白特异性结合。 4、应用E8 mAb初步建立了定量检测Sema3F的竞争ELISA方法。 5、初步应用E8 mAb对组织芯片中多种肿瘤组织中Sema3F表达进行定性检测，发现Sema3F在某些肿瘤中表达下调，提示可能参与肿瘤的发生发展。