蛋白A色谱中配基固定化及配基分子结构转换的光谱学研究

• 作 者: 王震
• 出 处: 天津大学
• 发表日期: 2021年06期
• 关键词: 蛋白A配基 圆二色谱 分子结构 蛋白-界面相互作用 等温滴定量热 荧光发射光谱

配基固定技术对于开发高吸附容量的蛋白A亲和色谱材料是至关重要的。为了揭示配基固定技术及固定化蛋白A配基分子与材料界面的相互作用机制,本文利用羧基化葡聚糖（CMD）包裹的磁性纳米粒子（Fe₃O₄@CMD纳米粒子）偶联蛋白A的突变抗体结合域Z（Z结构域）及其四串体合成了蛋白A纳米粒子;并在此基础上,系统地观察了配基与材料界面的相互作用,以期为蛋白A亲和色谱介质的开发奠定科学基础。本文采用化学共沉淀法合成了Fe₃O₄磁性纳米粒子,然后通过包埋法将CMD包裹在Fe₃O₄磁性纳米粒子表面,得到了Fe₃O₄@CMD纳米粒子。SEM、TEM、FT-IR、VSM和TGA等表征结果均表明,CMD成功地包裹在Fe₃O₄磁性纳米粒子的表面。本文构建了分别表达Z结构域（Z-CK）和其四串体（H₆-Z₄-CK）的突变菌株,经发酵和分离纯化获得高纯度的Z-CK和H₆-Z₄-CK蛋白。本文通过定向固定与随机固定方法将两种蛋白A配基分别固定于Fe₃O₄@CMD纳米粒子表面。在此基础上,将圆二色光谱（CD）和荧光光谱（FL）技术与等温滴定量热（ITC）技术相结合,系统地研究了蛋白A配基在Fe₃O₄@CMD粒子表面分子结构及其转换行为。CD和FL光谱结果表明,定向固定Z-CK的纳米粒子（Fe₃O₄@CMD-o Z粒子）表面配基分子结构受到其与材料界面相互作用的影响。在p H 4.5和p H 7.0条件下,纳米粒子表面带有负电荷,其与配基分子Z-CK中Lys和Arg残基侧链发生静电相互作用,诱导Fe₃O₄@CMD-o Z表面配基分子构象改变和结构的破坏,由此固定化配基分子的α螺旋含量降低,配基分子中的Tyr残基暴露于亲水性环境中。ITC结果也进一步显示,p H 7.0条件下Fe₃O₄@CMD-o Z纳米粒子与Ig G的结合具有较低的化学计量系数。当缓冲液p H升高至10.0时,由于缓冲液的p H值接近于Lys残基侧链的p K_a值,固定化配基在Fe₃O₄@CMD纳米粒子表面具有稳定的分子结构,在此条件下与Ig G结合具有较高的化学计量数。此外,聚合物配基能够提高配基的稳定性,其是通过降低带负电的纳米粒子表面与4Z结构域中带正电的Lys和Arg残基侧链的静电相互作用来实现的。ITC的结果显示在p H 7.0条件下每个4Z结构域结合较多的Ig G分子,在p H 10.0条件下h Ig G与Fe₃O₄@CMD-o Z₄纳米粒子结合的最大化学计量数为1.96。通过与氨基偶联的随机固定相比,定向固定更有利于配基的结构的稳定性。不同配基密度下的光谱及ITC的实验结果表明,在高配基密度下诱导的拥挤效应有利于维持四聚体配基的分子结构。本研究工作对在色谱材料上的蛋白A配基分子结构的转变提供了重要的见解,对于开发高效蛋白A色谱具有重要的指导意义。