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脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR,EC1.8.5.1)在植物抗坏血酸谷胱甘肽循环中发挥重要作用。本文以同倍性杂交物种高山松以及亲本油松和云南松为材料,利用RT-PCR分别从高山松、油松和云南松中克隆到两个DHAR基因,命名为PdDHAR1和PdDHAR2、PtDHAR1和PtDHAR2以及PyDHARJ1和PyDHAR2。我们对这六个基因的序列、编码蛋白的结构与功能进行了比较详细的研究,其主要结果如下：
⑴在高山松、油松和云南松中分别克隆得到两组基因:其中PdDHAR1、PtDHAR1和PyDHAR1的cDNA序列均包括648bp的开放阅读框,编码216个氨基酸的蛋白,预测分子量分别为24.4、24.35和24.35 kDa。PdDHAR2、PtDHAR2和PyDHAR2三个基因的cDNA序列包含681bp的开放阅读框,编码的蛋白包含227个氨基酸,预测分子量分别为26.03、25.96和26.03 kDa。系统发育分析发现三个DHAR1基因是直系同源基因,三个DHAR2基因也是直系同源基因,DHAR1和DHAR2是在陆地植物最近的共同祖先中发生的一次古老基因重复事件产生。高山松在物种形成过程中保留了油松的DHAR1拷贝以及云南松的DHAR2拷贝。蛋白质结构分析表明所有DHAR蛋白均具有典型的谷胱甘肽转移-酶结构。三个物种的DHAR蛋白结构高度保守,但DHAR1和DHAR2两组蛋白间在部分区域有构象的变化。
⑵通过RT-PCR分析基因表达模式,发现PtDHAR1和PtDHAR2在油松成年植株的叶、芽、根尖、茎韧皮部和根韧皮部以及幼株的根、茎、叶中表达,表明这两个基因是组成型表达基因,在油松的生长发育中可能发挥着重要作用。
⑶在大肠杆菌中高效表达并纯化了PdDHAR1、PdDHAR2、PtDHAR1、PtDHAR2和PyDHAR1五个重组蛋白。酶学活性分析显示五个蛋白只对底物DHA具有催化活性,证明这些DHAR蛋白均具有脱氢抗坏血酸还原酶活性。其中PdDHAR1、PtDHAR1和PyDHAR1对DHA的活性分别为1.492,1.498和0.005μmol/min per mg,而PdDHAR2和PyDHAR2的活性分别为0.388和0.285μmol/min per mg。酶动力学分析发现对第二底物DHA的的Km DHA值都在0.3-1.1 mM,预示着DHAR基因对底物DHA有相似的高亲和力。热力学稳定性结果显示PdDHAR2蛋白的热力学稳定性与其他三个蛋白有显著性差异。PdDHAR2蛋白在50℃时还保持着最高活性的87％,而PdDHAR1、PtDHAR1和PtDHAR2在50℃时只剩活性的27％、27％和31％,推测PdDHAR2蛋白是一个热稳定较高的酶,可能在适应高温环境中发挥重要作用。pH依赖性的检测结果显示,DHAR蛋白均在偏碱性的环境中发挥作用,其中PdDHAR2和PtDHAR2在pH7.5-9.5之间保持着80％以上的相对活力,而PdDHAR1和PtDHAR1的变化范围为7.8,表明前一对基因可能在更广泛的碱性环境中发挥作用。
⑷综合系统发育关系、基因表达模式、酶学性质和蛋白质三维结构分析,本论文从不同层次上系统地阐述了杂交起源的高山松基因组中DHAR基因的组成和进化模式:高山松DHAR1基因更类似于油松,而DHAR2基因则更类似于云南松,DHAR基因的选择性继承可能与杂种独特的生态适应性有一定的关联。