溶藻弧菌及其毒力相关基因的检测

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弧菌属为革兰氏阴性菌,嗜盐,广泛存在于海水中,是引起水产养殖鱼、虾、贝类等疾病的重要病原菌。其中,溶藻弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌和霍乱弧菌又是重要的食源性病原弧菌,副溶血弧菌、创伤弧菌和霍乱弧菌对人类的致病性已得到广泛的重视,而溶藻弧菌虽然早在1979年就有报道称其对人类具有致病性,但目前针对它的研究主要集中在对水产养殖动物的危害上,对哺乳动物特别是人类的危害缺乏研究,导致其在临床或食品风险评估中容易被忽略。本论文设计了高通量的核酸检测方法,对以上4种弧菌特别是溶藻弧菌及其毒力相关基因进行了检测,结果如下:1、本研究以细菌16S rRNA基因为扩增内标靶序列,针对溶藻弧菌gyrB基因、副溶血弧菌Collagenase基因、创伤弧菌vvhA基因、霍乱弧菌ompW基因,分别设计特异性引物,建立5重PCR体系,对其灵敏度和特异性进行评价,并将建立的5重PCR体系应用于弧菌的筛选。结果显示该5重PCR检测体系对混合模板中副溶血弧菌、溶藻弧菌和创伤弧菌的灵敏度达10CFU/mL,霍乱弧菌的灵敏度达105CFU/mL,并能有效指示PCR反应的假阴性,将建立的多重PCR体系应用于从21个不同来源样品中分离出的63株疑似弧菌菌株的鉴定,其结果与生理生化鉴定结果一致。2、针对弧菌的常见毒力相关基因(toxR、Collagenase、toxS、trh、tdh、tlh、UreR、FlaA、ompW、AspA、fur),建立了2套6重PCR体系,该体系能在检测11种毒力相关基因的同时能够鉴别溶藻弧菌和副溶血弧菌,将建立的方法应用于环境分离的溶藻弧菌和副溶血弧菌中毒力相关基因的调查,结果显示,这些毒力相关基因在环境分离的溶藻弧菌和副溶血弧菌中均有不同程度的分布。该体系为溶藻弧菌和副溶血弧菌毒力相关基因的调查和研究提供了方法。3、建立了一套基于多重串联式PCR的基因碟片技术检测体系,该体系在能够定量检测4种常见食源性病原弧菌溶藻弧菌(gyrB为靶基因)、副溶血弧菌(Collagenase为靶基因)、创伤弧菌(vvhA为靶基因)和霍乱弧菌(ompW为靶基因)的同时还能够定量检测8种毒力相关基因(tdh, trh, tlh, UreR, FlaA, fur, AspA, ompW),同时还包含了16S rRNA基因内参用作相对定量。该技术能应用于弧菌的快速定量检测和毒力相关基因表达量的分析,为快速、准确、高通量、定量分析弧菌及其毒力相关基因提供了新方法。
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