犬瘟热病毒PS株基因组序列分析及荧光定量RT-PCR法对病毒分布规律的研究

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犬瘟热(Canine distemper, CD)是由犬瘟热病毒(Canine distemper virus, CDV)感染引起的烈性传染病,具有高致病性和高死亡率等特点,对我国的毛皮动物养殖业,野生动物保护业及养犬业造成了很大的危害。目前虽然已经用疫苗来预防犬瘟热的发病,但是由于犬瘟热病毒出现了大量变异株,疫苗不足以来控制犬瘟热的流行,因此研究新出现的毒株的遗传变异规律及病毒攻击的靶器官,对于犬瘟热的防控来说十分重要。本研究中的CDV PS(磐石株)株由发病的貉子组织中分离,通过活体动物传代和接种细胞,最终在Vero细胞中稳定繁殖,并被命名为CDV-PS株。通过参考GenBank上野毒株A75/17的全基因组序列设计了10对引物,PCR扩增了覆盖CDV-PS株的全基因组的10个片段,并进行克隆、测序及拼接。对CDV-PS株全基因组进行序列测定,与GenBank中参考毒株进行同源性分析,结果发现PS株基因组与MKY-KM08分离株(HM852904.1)基因序列同源性高达97.9%,与其他野毒株的同源性在93.0%~97.0%之间,与CDV3疫苗株和Onderstepoort疫苗株的同源性最低,分别为93.2%和93.0%。基于全基因组序列绘制的系统进化树表明,所有CDV分离株分为两支,疫苗株和野毒株,PS株和MKY-KM08株位于同一支,属于亚洲1型。本项研究通过实时荧光定量PCR方法,对CDV-PS株感染的犬组织的病毒分布进行研究。对收集的22份犬瘟热病毒临床样本拭子液进行检测,均能检测到。PS株病毒感染犬后,通过荧光定量RT-PCR方法检测病毒在感染犬体内的分布规律及病毒核酸在血液和拭子液中的含量变化,结果表明,肝、脾、肺、脑、肠系膜淋巴结多种脏器中均有病毒存在,在脾和脑中病毒含量最高(分别达到5.2×1010拷贝/mL和1.0×109拷贝/mL)。表明实时荧光定量PCR方法可用于犬瘟热病毒核酸定量检测,为该病毒的致病机理及病毒传播途径的研究提供了一种新的技术手段。通过对CDV-PS株全基因组序列测定及生物学特性的分析和感染犬后病毒在动物体内分布规律的研究,来探讨CDV-PS株的遗传进化规律,分析其易感染的动物组织,从而为CDV的预防和早期诊断提供依据。
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