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猪肺炎性疾病是目前集约化养猪业中危害极大的一类呼吸道传染病,且病因复杂,常表现为多种病原菌的继发感染和混合感染。临床上,单一用药往往难以有效控制猪肺炎性疾病,应用两种抗菌药物发挥药物间的相互作用可适当提高疗效和减少耐药菌的产生。本课题利用盐酸头孢噻呋、盐酸多西环素、甲磺酸达氟沙星、酒石酸泰乐菌素、磷酸替米考星和氟苯尼考等治疗肺炎性疾病常用药物分别对猪链球菌、猪胸膜肺炎放线杆菌和副猪嗜血杆菌的药敏试验和联合药敏试验,结合药物间的配伍禁忌,筛选出最佳的联合用药组合为盐酸多西环素和氟苯尼考。临床上,盐酸多西环素和氟苯尼考在猪体内的生物利用度低和半衰期短,使用时需要加大给药剂量和多次给药,不仅治疗效果不理想,还给兽医工作者们带来了极大的不便,为了提高二者对猪肺炎性疾病的治疗效果,本课题利用羟丙基-β-环糊精、聚乙烯吡咯烷酮和羟丙基甲基纤维素等药用辅料结合饱和水溶液法和高压均质技术研制盐酸多西环素与氟苯尼考复方混悬液,同时开展该复方混悬液对猪链球菌cvcc607的药效学-药动学同步模型研究,为临床使用制定科学合理的给药方案,为了开发治疗猪肺炎性疾病新型高效的药物以解决猪肺炎性疾病的治疗难题。1.联合用药组合的筛选参考临床实验室标准化研究所(CLSI)制定的相关标准,采用微量肉汤稀释法分别测定盐酸头孢噻呋、甲磺酸达氟沙星、盐酸多西环素、酒石酸泰乐菌素、磷酸替米考星和氟苯尼考对临床分离的6株猪链球菌、1株猪胸膜肺炎放线杆菌和6株副猪嗜血杆菌的最低抑菌浓度(MIC)。在此基础上采用棋盘法进行联合药敏试验测定抗菌药物间的相互作用,选取具有协同作用或相加作用的药物组合,同时研究抗菌药物在猪体内的处置过程,选取药动学参数接近的一组药物组合。试验结果表明,盐酸多西环素和氟苯尼考对上述临床分离菌的MIC分别为0.125～1 μg/mL和0.25～1μg/mL,二者较其他抗菌药物有较好的敏感性,联合用药时对链球菌、胸膜肺炎放线杆菌以及副猪嗜血杆菌均表现出一定的协同作用或相加作用,且二者的药动学参数较为接近,药物间也无理化性质的配伍禁忌,故选取盐酸多西环素与氟苯尼考研制复方制剂。2.盐酸多西环素与氟苯尼考复方混悬液的研制采用饱和水溶液法结合高压均质技术研制盐酸多西环素与氟苯尼考复方混悬混悬液。采用单因素对照试验筛选出最佳的主分子羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)、表面活性剂聚乙烯吡咯烷酮(PVP)以及助悬剂羟丙基甲基纤维素(HPMC)等的用量;运用高效液相色谱法(HPLC)测定药物包合率;按照兽药典中推荐的“转桨法”测定盐酸多西环素和氟苯尼考在PBS缓冲液(pH=7.4)中的释放度;考察混悬液的外观性状、通针性、沉降体积比、重分散性、pH值、靶动物注射部位的刺激性和溶血性等制剂评价指标;最后研究复方混悬液的加速和长期稳定性。结果表明:本课题成功研制出盐酸多西环素与氟苯尼考复方混悬液,其中,羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)、盐酸多西环素、氟苯尼考的用量比例为3:1:1、表面活性剂含量为5%、助悬剂含量为0.25%;盐酸多西环素和氟苯尼考的包合率分别为45.28%、89.69%;释放度试验显示盐酸多西环素和氟苯尼考在PBS缓冲液中具有一定的缓释性能;沉降容积比为0.999、pH值为5、通针性和重分散性良好、注射部位无刺激性和溶血性现象等均符合兽药典中对混悬液的相关规定;加速试验和长期稳定试验结果表明本混悬液在避光保存条件下稳定性良好。3.药效学-药动学(PK-PD)同步模型研究分别建立了血浆和肺泡灌洗液中盐酸多西环素和氟苯尼考的高效液相色谱(HPLC)检测方法,考察检测方法的线性、灵敏度、特异性、回收率和精密度及稳定性。给猪皮下接种约3～5mL量的1.2×109 CFU/mL猪链球菌cvcc607建立仔猪患病模型。给患病猪和健康猪肌注0.2 mL/kg的盐酸多西环素与氟苯尼考复方混悬液后分别在不同时间点采集血液和肺泡灌洗液进行浓度测定。采用Winnonlin药动学软件对药物浓度数据进行拟合。采用微量肉汤稀释法考察盐酸多西环素与氟苯尼考联合用药时在肺泡灌洗液中的最低抑菌浓度,并在此基础上配制系列浓度盐酸多西环素与氟苯尼考肉汤进行杀菌试验,在不同时间点分别取出100 μL,系列稀释后采用平板计数法绘制杀菌曲线确定盐酸多西环素与氟苯尼考联合用药时的抗菌类型。把不同时间点采集的肺泡灌洗液过滤除菌后,接种猪链球菌cvcc607,放入细菌培养箱培养。分别在不同时间点采用平板计数法计数活菌数并绘制间接体内杀菌曲线。通过Winnonlin软件模拟半体内AUC/MIC值与抗菌疗效之间的关系,确定PK-PD模型方程,计算给药剂量和模拟给药间隔。结果表明盐酸多西环素与氟苯尼考在健康猪和患猪链球菌病体内均符合吸收一室模型,其中盐酸多西环素和氟苯尼考在患病猪肺组织中的相关药动学参数如下:吸收半衰期(T1/2ka)分别为0.290±0.054 h和0.178±0.069h;消除半衰期(T1/2ke)分别为 18.074±1.967h和 13.462±2.387h;药时曲线下面积(AUC)分别为 64.069±5.452 h·μg/mL 和 59.973±8.007 h·μg/mL;峰浓度(Cmax)分别为 2.296±0.084 μg/mL 和 2.913±0.177 μg/mL;平均滞留时间(MRT)分别为25.001±5.369 h 和 28.532±6.913 h;清除率(CL)分别为 0.031±0.002 L/h/kg 和0.033±0.004 L/h/kg。盐酸多西环素和氟苯尼考在肺泡灌洗液中的最低抑菌浓度分别为0.125μg/mL和0.25μg/mL,与培养基中所测的数据一致,符合PK-PD模型拟合要求。杀菌曲线显示出盐酸多西环素与氟苯尼考联合用药的杀菌类型为浓度依赖型,拟合PK-PD模型时参考半体内AUC/MIC。通过Winnonlin软件模拟出PK-PD的模型方程为E=2.589-(8.325*C0.909)/(19.7230.909+C0.909)。结合给药方程X=d×(AUCex vivo/MICtested)/(AUCin vivo/MICtarget)(MICtarget选取猪链球菌cvcc607)计算出的给药剂量为0.019 mL/kg～0.198 mL/kg,Winnonlin 软件拟合出的给药间隔为 78.787 h。综上所述,本课题成功研制出了盐酸多西环素与氟苯尼考复方混悬液,通过对猪链球菌cvcc607的药效学-药动学(PK-PD)同步模型研究,制定出了一套科学合理给药方案。本研究为治疗猪肺炎性疾病提供一种高效的新制剂,将有助于解决猪肺炎性疾病的治疗难题。