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1.目的： 本文以具有解表清里、升清止利之功效的经典方剂葛根芩连汤为研究对象，运用液质联用技术对其活性成分在大鼠体内的药代动力学行为进行系统的研究，探讨其体内过程。以药代动力学数据和解热抗炎的药理学表征为指标，运用课题组前期设计的计算软件进行PK-PD相关性研究，获得相应的药动学-药效学参数，为建立中药复方多组分药动-药效研究提供方法学探讨，也可为复方中药质量控制、复方配伍机制的研究及指导临床用药奠定基础。 2.方法与结果： (1)建立了同时测定葛根芩连汤中黄酮类(黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素、甘草苷、甘草素)、异黄酮类(葛根素、大豆苷、大豆苷元)、生物碱类(小檗碱、药根碱、巴马汀、黄连碱)及皂苷类(甘草酸、甘草次酸)等共15个成分的液相-串联质谱联用(LC-MS/MS)测定方法。所建立的分析方法简便快速、稳定可靠。同时测定了葛根芩连汤全方组及中医理论指导下制定的不同配伍组(葛根组、芩连组、葛根甘草组、芩连甘草组、葛根芩连组)中多组分的相应成分的含量，并进行分析比较。结果表明：葛根芩连汤中共测得14个有效组分，甘草次酸未被检测出。比较单方及全方的含量测定结果，均有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。葛根素、甘草素在单方中的含量约为全方中含量的3倍，巴马汀、小檗碱和药根碱在单方中的含量约为全方中含量的1.5～2倍，可能是复方在煎煮过程中各单味药化学成分相互作用产生沉淀，影响主要有效成分的溶出。将六个不同配伍组测得的含量进行两两比较，结果表明： ①葛根素、大豆苷元含量为葛根组>全方组>葛根甘草组>葛根芩连组，其中葛根素在单方中的含量大约是在各配伍组中含量的2～3倍，说明配伍明显的抑制了葛根素的溶出；大豆苷含量为葛根甘草组>葛根组>葛根芩连组>全方组；说明佐使药甘草能促进大豆苷的溶出。 ②黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素含量均在芩连甘草组中最高，葛根芩连组中最低。说明甘草促进黄芩成分的溶出，葛根抑制黄芩成分的溶出。小檗碱、药根碱、巴马汀和黄连碱含量亦均在芩连甘草组中最高，葛根芩连组中较低，跟黄芩中成分受影响的情况一致。说明佐使药甘草促进臣药成分的溶出，君药葛根抑制臣药芩连成分的溶出。 ③甘草苷、甘草素和甘草酸在葛根甘草组中含量最高，芩连甘草组与全方组比较无显著性差异，说明君药葛根促进甘草成分的溶出，臣药芩连抑制甘草成分的溶出。研究结果可为葛根芩连汤不同配伍药代动力学研究提供化学物质基础。 (2)本文采用液液萃取法对血浆样品进行预处理，建立了以柚皮苷为内标的葛根芩连汤多组分在大鼠血浆的LC-MS/MS测定方法。该方法回收率、精密度、准确度等均满足体内药物分析的要求。SD大鼠分别灌胃给予六个不同配伍组，测定给药后不同时间点血浆中各组分的浓度，得血药浓度-时间曲线，采用DAS软件计算各组分的药动学参数。结果表明: ①葛根素入血吸收量大小依次是：葛根甘草组>全方组>葛根芩连组>葛根组，大豆苷元入血吸收量大小依次是：葛根甘草组>葛根芩连组>全方组>葛根组。结果提示佐使药甘草和臣药芩连对君药葛根中葛根素和大豆苷元入血吸收均有促进作用，但甘草和芩连的共同加入，其促进作用反而降低，说明甘草和芩连有相互制约的作用。 ②臣药中黄芩有效成分黄芩苷、汉黄芩苷、汉黄芩素其Cmax和AUC值在全方中最高，其次是葛根芩连组、葛根甘草组，在芩连组中最小。比较CL值，黄芩苷、汉黄芩苷在芩连组中最大，其余各组相近；汉黄芩素在葛根芩连组中最大，其余各组相近。说明葛根和甘草均促进黄芩苷、汉黄芩苷、汉黄芩素的入血吸收。并且葛根减慢黄芩苷和汉黄芩素的消除时间、加快汉黄芩苷的消除时间，同时降低黄芩苷、汉黄芩苷的清除量，增大汉黄芩素的清除量。 ③臣药中黄连有效成分小檗碱、药根碱、巴马汀和黄连碱，其Cmax和AUC值在全方中最高，在芩连组中最小。比较T1/2值，4个生物碱成分半衰期值在芩连组中最小，其余各组相近。比较CL值，4个生物碱成分均在葛根芩连组中最小，而药根碱和黄连碱在芩连甘草组中最大，巴马汀的清除率在芩连组中最大，小檗碱在全方中最大。说明葛根和甘草均可促进生物碱成分的入血吸收，甘草促进了药根碱和黄连碱的清除，葛根可同时减少上述4个生物碱成分的清除。 ④佐使药甘草中的成分，其Cmax和AUC值大小依次是葛根甘草组>全方组>芩连甘草组，君药葛根可增加甘草苷，甘草素、甘草次酸入血吸收，而臣药芩连可降低甘草中甘草苷、甘草素、甘草次酸的吸收程度。 (3)采用LC-MS/MS法测定大鼠经灌胃给予葛根芩连汤后，不同时间点心、肝、胃、肺、肾、牌、肠七大组织中各组分的浓度。结果显示，各组分在大鼠体内分布较为广泛，且在胃、肠中分布较多，其次是肝、肾、心、肺。葛根芩连汤在临床上主要用于湿热泄泻、细菌性痢疾、胃肠型感冒、急性胃肠炎等证。病灶部位主要在胃肠部，与各组分分布规律基本一致。 (4)采用LC-MS/MS测定大鼠经灌胃给予葛根芩连汤后，不同时间段尿液、胆汁和粪便中上述各成分的浓度。结果显示，葛根素和大豆苷主要经肾脏通过尿排泄，累积排泄率分别为0.261％和0.078％，葛根素经胆汁和粪便也有排泄，但大豆苷粪便排泄基本测不到。大豆苷元经粪便排泄，累积排泄率为0.414％，尿和胆汁排泄率分别为0.334％和0.280％。黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素均以尿排泄为主，其次是胆汁排泄，黄芩素和汉黄芩素尿液累积排泄率分别为15.422％和6.648％，较黄芩苷和汉黄芩苷排泄量多，黄芩苷和汉黄芩苷尿液累积排泄率分别为为1.434％和1.579％。小檗碱、巴马汀、黄连碱和药根碱尿液排泄少在0.001％～0.004％之间，粪便排泄率在0.0208％～0.264％之间，相对于尿液和粪便排泄，胆汁累积排泄率较多在0.086～0.549％。甘草苷胆汁排泄较尿液、粪便高，其累积排泄率为0.162％、尿液排泄为0.0556％。甘草素尿液累积率排泄为0.414％，胆汁排泄为0.247％，粪便排泄少。 (5)以葛根芩连汤中君药葛根、臣药芩连、佐使药甘草三个组别为研究对象，采用Cocktail探针药物法，大鼠经灌胃给予葛根组、芩连组和甘草组7天后，均同时以尾静脉注射给予5种CYP450同工酶CYP1A2、CYP2C9、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A1/2的特异性探针药物咖啡因、甲苯磺丁脲、右美沙芬、氯唑沙宗和咪达唑仑。采用LC-MS/MS检测不同时间点大鼠血浆中各探针药物的浓度，用统计软件SPSS19.0比较对照组与实验组各种探针AUC的差别，评价各组药物对CYP450同工酶诱导或抑制的影响。结果显示给予葛根组的大鼠CYP2D6及CYP2E1的水平显著高于对照组，CYP1A2、CYP2C9、CYP3A1/2的水平显著低于对照组。给予芩连组的大鼠CYP1A2及CYP2E1的水平高于对照组，其余3种亚型酶的水平无显著差异。给予甘草组的大鼠CYP1A2、CYP2C9、CYP2D6及CYP2E1的水平显著低于对照组，CYP3A1/2的水平显著高于对照组。给予全方组的大鼠CYP3A1/2、CYP2C9、CYP2D6水平显著低于对照组，CYP1A2、CYP2E1的水平无显著差异。结果提示，灌服葛根单方7天能抑制大鼠CYP2D6及2E1活性，诱导CYP1A2、CYP2C9、CYP3A1/2活性。芩连能抑制CYP1A2及CYP2E1活性，对其余3种亚型酶无影响。甘草能诱导CYP1A2、CYP2C9和CYP2D6及CYP2E1的活性，抑制CYP3A1/2的活性。葛根芩连汤能诱导CYP3A1/2、CYP2C9、CYP2D6，对其余2种亚型酶无影响。研究结果可结合各成分肝微粒体亚型酶的归属，从代谢酶的角度为葛根芩连汤不同配伍机制研究奠定基础。 (6)研究葛根芩连汤解热及抗炎作用。采用干酵母致热模型，以体温升温值和升温抑制百分率为指标，对比正常组与模型组指标，考察干酵母致热模型的发热持续时间与发热强度；比较模型组与给药组指标大小，考察葛根芩连汤解热作用。采用角叉菜胶足趾肿胀模型，以足趾肿胀容积和足趾肿胀抑制百分率为指标，对比正常组与模型组指标，考察角叉菜胶足趾肿胀模型的致炎持续时间与致炎强度；比较模型组与给药组指标大小，考察葛根芩连汤抗炎作用。结果显示干酵母致热模型体温变化特点为造模后3h开始上升，4h体温上升最快，7h至9h体温最高，发热持续时间约为12h且体温平均升高最大值为2℃，葛根芩连汤能显著降低体温升高值。角叉菜胶大鼠足趾肿胀模型变化特点为造模后立即肿胀，2h后肿胀程度加重，2.5h至3h为肿胀高峰，肿胀持续时间约为8h且平均最高肿胀度为0.7ml。结果显示葛根芩连汤具有解热及抗炎的药理作用。药动学数据与整体药效学数据结合分析，建立的PK-PD结合模型已经成功地将血药浓度-效应滞后环转化为效应室浓度-效应的线性正变关系，为建立以中医药理论为指导、中药药代动力学和药效动力学分析为手段的中药复方研究的新方法奠定基础，提供一个新的思路。 3.结论： 本文首先建立了葛根芩连汤LC-MS/MS测定方法用于测定全方、单方及不同配伍组各组分含量，方法简便快速灵敏；其次对葛根芩连汤在大鼠体内的多组分药代动力学进行了系统研究，初步阐明了各组分在大鼠体内的吸收、分布、代谢、排泄规律及其对肝药亚型酶活性的影响；对葛根芩连汤解热抗炎药效进行了研究，得到药效动力学参数，采用计算机模型与上述实验中药代动力学参数结合，建立PK-PD模型。研究工作为探讨葛根芩连汤作用机理提供科学依据，也为中药复方研究提供一种有益的模式。