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高性能生物催化剂的制备及使用是工业生物技术领域的重要组成部分。纳米纤维由于具有载酶量高、传质阻力小、制备方法简单而且表面改性容易、无纺布膜的形式使生物反应器的构建和操作非常容易等优势,已经被广泛用作固定化酶的载体,并在生物过程工程中展现出良好的应用前景。材料中的无机盐对蛋白质分子与材料之间相互作用的影响是一个非常重要但被长期忽略的研究领域。深入理解固定化酶载体所含的无机盐在酶固定化过程中发挥的作用对于制备高性能的酶催化剂将具有重要的指导意义。本论文利用纳米纤维中添加氯化锂对纳米纤维酶的制备和催化性能的调控作用,制备出了高性能的纳米纤维固定化酶,并在生物过程工程中得到了成功的应用。具体研究内容包括如下几个方面:
(1)利用静电纺丝技术制备出了直径在100-200 nm而且比较均匀的聚氨酯纳米纤维,考察了氯化锂对α-胰凝乳蛋白酶(α-chymotrypsin,CT)在纤维表面吸附行为的影响。结果发现,电纺过程中添加氯化锂可以极大程度地增大纤维对酶蛋白的吸附能力,负载量最高可达640 mg/g-纤维,为未添加氯化锂纤维的9倍。这种强的不可逆吸附作用导致蛋白质分子在纤维表面的大量团聚形成亚微米结构的蛋白团聚体,但是这种酶聚集体表现出低的活性回收率和稳定性。
(2)利用添加氯化锂的纳米纤维与蛋白之间的这种不可逆吸附作用,采用一些低成本蛋白(如牛血清白蛋白、鱼精蛋白)在纤维上的大量吸附来对纤维表面进行改性,然后通过交联剂(戊二醛)把酶交联到吸附的蛋白上制备出多层固定化酶。这种多层固定化酶的方法在保证高的载酶量和活性回收率的同时,使酶的稳定性得到了大幅度的提高:纳米纤维固定化CT在4℃下保存8个月无任何活性损失；50℃水浴中2 h活性保持80％以上；无水甲醇浸泡2 h后剩余活性高于50％。同时,纳米纤维固定化CT在异辛烷中催化酯交换反应的活性提高为自由酶的20万倍。
(3)采用多层固定化酶的方法制备的聚氨酯纳米纤维固定化酶还具有独特的活性恢复能力。在甲醇中失活或者在高温下失活后的固定化酶浸泡于缓冲液,活性可以显著恢复。纳米纤维固定化CT、氯过氧化物酶和脂肪酶AK在无水甲醇中浸泡2 h后投入缓冲液浸泡2 h,活性可以分别从34％恢复到57％,12％恢复到18％,46％恢复到87％。
(4)多层固定化技术制备的纳米纤维脂肪酶用于催化生物柴油的合成,结果表明聚氨酯纳米纤维中添加适量的氯化锂对固定化的脂肪酶存在显著的激活作用。固定化在含5 wt％氯化锂的纳米纤维上的脂肪酶表现出最高的催化能力和重复利用性:25℃反应2 h生物柴油转化率达到90％以上,催化速率是商品化固定化脂肪酶Novozymes435的110倍,而且可以重复使用42次没有明显的活性降低。此外,纳米纤维脂肪酶催化生物柴油合成反应的效率对水的依赖性也显著降低,在无水体系中仍具有优良的催化活性。多层固定化酶的方法还应用于制备纳米纤维氯过氧化物酶,该酶膜用于催化苯乙烯氧化反应的催化效率为自由酶的5.5—7.5倍；重复使用5次后活性保留50％以上。
(5)尝试了利用阴离子表面活性剂与CT形成离子配对得到有机相可溶性酶,然后与聚氨酯共纺直接制备出具有生物活性的纳米纤维。共纺法得到的纳米纤维酶同样具有良好的活性和稳定性。但是与多层酶固定化方法相比,共纺法受到酶分子尺寸、带电性、对表面活性剂的敏感性等因素的影响,不具备良好的普适性。例如,利用共纺法制备纳米纤维共纺氯过氧化物酶时,酶从水相到有机相中的转移率和有机相中酶的活性收率都很低。
本文利用氯化锂来调控蛋白质分子与聚氨酯纳米纤维表面相互作用的研究,对于深入理解蛋白质与固体的界面相互作用、制备生物相容性材料具有重要的指导意义。利用氯化锂诱导的蛋白质与纳米纤维的强烈不可逆吸附作用提出的多层酶固定化方法,已被证实是一种具有普适性的制备高效生物催化剂的新思路,其高活性、高稳定性以及独特的活性恢复能力在生物过程工程领域将具有广阔的应用前景。