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葡萄霜霉病是葡萄生产上的重要病害,在世界各葡萄产区均有发生,危害严重。引起该病的病原菌葡萄生单轴霉(Plasmopara viticola)为活体营养型专性寄生菌,只侵染葡萄。本研究目的在于筛选对葡萄霜霉病有显著防治效果的有益内生细菌,并探究其生防机制,为葡萄霜霉病生防制剂的开发和应用提供菌株资源和技术支持。1.葡萄霜霉病生防内生细菌的分离筛选和鉴定本研究从健康葡萄叶片中共分离获得内生细菌239株,经离体叶盘法筛选和田间防效验证,获得两株对葡萄霜霉病防效明显的内生细菌GLB191和GLB197。通过16S rDNA、gyrA、gyrB基因鉴定,菌株GLB191为枯草芽胞杆菌,菌株GLB197为短小芽胞杆菌。2.枯草芽胞杆菌GLB191定殖机制研究为研究生物膜形成和趋化性对枯草芽胞杆菌GLB191叶部定殖能力和生防活性的影响,本研究分别构建了 GLB191生物膜形成相关基因srfAC、hag和趋化性关键基因cheA的缺失突变体菌株。定殖能力和生防活性检测结果显示,△srfAC和△hag在葡萄叶片的定殖量显著降低,叶表和叶内定殖能力均明显减弱,AcheA对定殖量无显著影响;△srfAC和Ahag对葡萄霜霉病的生防活性均显著降低,AcheA不影响生防活性。以上实验结果表明,枯草芽胞杆菌GLB191在葡萄叶片的定殖能力与生物膜形有关,受趋化性影响不显著,定殖能力影响GLB191对葡萄霜霉病的生防活性。3.枯草芽胞杆菌GLB191生防相关代谢产物研究对枯草芽胞杆菌GLB191代谢液的生防活性检测发现,其代谢液可显著抑制P.viticola孢子囊萌发和病害发生,且抑制效果与发酵液相同,说明GLB191代谢液发挥主要生防作用。为明确代谢液中的活性成分,本研究从基因组水平出发,通过全基因组测序和比较分析发现,GLB191基因组中含有13个次生代谢产物基因簇,其中合成抗生素lactobin A的基因簇为GLB191特有基因簇。对这13个基因簇的关键合成基因分别进行敲除突变,并检测突变体菌株的生防活性,结果显示,非核糖体肽合成酶(Nrps)基因簇的关键基因srfAA(surfactin)、ppsB(plipastatin)、dhbF(bacillibactin),以及影响二酮哌嗪类化合物diketopiperazine合成的关键基因yvmCcypX的缺失显著影响对葡萄霜霉病的生防活性。以上实验结果表明,GLB191基因组中Nrps基因簇合成的抗生素plipastatin、surfactin、bacillibactin和二酮哌嗪类化合物diketopiperazine是对葡萄霜霉病有生防作用的重要活性物质。4.短小芽胞杆菌GLB197代谢产物生防活性初探对短小芽胞杆菌GLB197代谢液的生防活性检测发现,其代谢液与发酵液具有相同的抑菌效果,均可显著抑制P.viticola孢子囊萌发和病害发生,说明GLB197代谢液发挥主要生防作用。通过GLB197全基因组测序和次生代谢相关基因分析发现,GLB197基因组中含有6个次生代谢产物基因簇,这些基因簇合成产物的生防活性有待进一步研究。