论文部分内容阅读
目的:血管钙化是多种疾病的病理基础,与动脉粥样硬化关系最为密切,它使动脉机械性质发生了改变,可造成血栓的形成、粥样斑块的破裂、外周血管堵塞缺血、主动脉狭窄、心肌缺血和梗死等严重后果,增加了气囊血管成形术中血管破裂和心血管生物修复术失败的风险。导致心脏瓣膜钙化的主要原因是机械损伤和炎症,累及的主要部位在主动脉瓣和二尖瓣,钙化的结果可致瓣膜狭窄和/或返流,是心脏瓣膜置换术的重要原因所在。以上所述的血管以及心脏瓣膜的钙化是心血管发生钙化的常见部位。以往认为血管细胞钙化是钙盐在细胞内及细胞外基质的被动沉积,是血管细胞老化的标志,然而新近的研究发现血管细胞钙化是一个复杂的、主动的、可调控的生物学过程,是活跃的血管结构的骨化,类似于骨和软骨形成过程中的骨化。钙调神经磷酸酶（Calcineurin, CaN）是一种丝氨酸-苏氨酸蛋白磷酸酶。CaN广泛分布在多种组织细胞中,是一种多功能信号酶,主要通过使NFAT等底物的去磷酸化及核内转位,激活下游基因使其转录,参与调节多种细胞的功能。最近研究证实,CaN信号通路参与了血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell,VSMC）的增殖和功能的维持。不同的刺激物（如PDGF2BB、凝血酶和AngⅡ等）可诱导NF-AT传递胞外信号,激活VSMC核内相关基因进行转录,最终刺激VSMC增殖,这一过程可被CaN特异性抑制剂CsA阻断。环鸟苷酸依赖的蛋白激酶（cGMP-dependent protein kinase,PKG）是广泛的存在于真核细胞内部的一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。一氧化氮（nitric oxide, NO）能调节多种信号传导通路,可促进细胞内cGMP合成,然后由cGMP激活PKG进而调节局部和全身信号等。近年来研究CaN与血管钙化中PKG关系的实验有很多,而CaN在钙化的VSMCs胞浆内与PKG I的关系目前国内外尚未见有报道。本试验采用磷酸二氢钠建立大鼠主动脉VSMCs钙化模型,测定细胞PKG I及CaN mRNA、蛋白质的表达及活性,并观察CaN对PKG I表达的影响,初步探讨CaN及PKG I对血管细胞钙化的调节作用,为血管细胞钙化的临床防治提供新的思路。方法:大鼠胸大动脉VSMCs传代完成后,将实验细胞随机分为3组。A组:对照组;B组:钙化组;C组:干预组（简称CsA组）。A组给予正常对照的GMDM培养基3ml,B组给予磷酸二氢钠配制浓度为2mmol/L的GMDM培养基3ml,C组给予磷酸二氢钠配制浓度为2mmol/L的GMDM培养基3ml同时加入浓度为5mg/L的环保霉素A（CsA）30ul,分别培养6天,每3天换液一次,于第6天收集细胞。茜素红染色示钙化组大鼠主动脉VSMCs呈梭形,排列紊乱,可见大量褐色钙化点,提示细胞钙化成功。取材后每组用Ellesa法测定大鼠主动脉VSMCs CaN、Ca2+活性,实时荧光定量反转录PCR法测定CaNB mRNA和PKG I mRNA,Western blot测定CaNB及PKG I蛋白定量,采用比色法测定碱性磷酸酶（ALP）活性;所有数据以均数±标准差（x±s）表示,运用SPSS 13.0统计软件,首先对计量资料进行正态性检验及方差齐性检验,组间资料比较应用单因素方差分析,两两比较应用LSD-t检验,P<0.05即有统计学意义。结果:（1）茜素红染色结果示对照组大鼠主动脉VSMCs呈梭形,排列整齐,未见钙化点;钙化组大鼠主动脉VSMCs呈梭形或多角形,排列紊乱,可见褐色钙化点;CsA组大鼠主动脉VSMCs呈梭形或多角形,排列紊乱,也可见大量褐色钙化点。（2）实时荧光定量反转录PCR法结果显示:钙化组与对照组对比:钙化组CaNB mRNA（6.27±1.45）较对照组（1.10±0.28）表达显著增加（P<0.01）;钙化组PKGⅠmRNA表达（0.26±0.07）较对照组（0.89±0.17）表达显著减少（P<0.01）;CsA组与对照组对比:CsA组CaNBmRNA（3.38±0.77）较对照组（1.10±0.28）表达显著增加（P<0.01）;CsA组PKGⅠmRNA（0.60±0.12）较对照组（0.89±0.17）表达显著减少（P<0.01）;钙化组与CsA组对比:CsA组CaNB mRNA（3.38±0.77）较钙化组（6.27±1.45）表达显著减少（P<0.01）。CsA组PKGⅠmRNA（0.60±0.12）较钙化组（0.26±0.07）表达显著增加（P<0.01）。（3）Western blot法测定结果显示:钙化组与对照组对比:钙化组CaNB蛋白（69.11±2.51）较对照组（29.9±1.39）表达显著增加（P<0.01）,PKGⅠ蛋白（0.32±0.01）较对照组（1.54±0.02）表达显著减少（P<0.01）;CsA组与对照组对比:CsA组CaNB1蛋白（48.22±2.47）较对照组（29.9±1.39）表达显著增加（P<0.01）,PKGⅠ蛋白（0.77±0.03）较对照组（1.54±0.02）表达也显著减少（P<0.01）; CsA组与钙化组对比:CsA组CaNB蛋白（48.22±2.47）较钙化组（69.11±2.51）表达显著减少（P<0.01）,PKGⅠ蛋白（0.77±0.03）较钙化组（0.32±0.01）表达显著增加（P<0.01）。（4）ELISA法测定大鼠主动脉VSMCs CaN活性:钙化组（21.47±1.86 IU/L）较对照组（14.31±0.24 IU/L）表达显著增加（P<0.01）,CsA组（15.34±0.14 IU/L）较对照组（14.31±0.24 IU/L）表达无显著变化（P>0.05）,CsA组（15.34±0.14 IU/L）较钙化组（21.47±1.86 IU/L）表达显著减少（P<0.01）。（5）ELISA法测定大鼠主动脉VSMCs Ca2+含量:钙化组（9.01±0.32 pg/ml）较对照组（6.03±0.33 pg/ml）Ca2+浓度显著增加（P<0.01）,CsA组（10.39±0.70 pg/ml）较对照组（6.03±0.33 pg/ml）Ca2+浓度显著增加（P<0.01）,CsA组（10.39±0.70 pg/ml）较钙化组（9.01±0.32 pg/ml）Ca2+浓度显著增加（P<0.05）。（6）用比色法测定细胞内ALP活性（U·g-1protein）,相对于对照组（38.74±2.23）,钙化组的ALP活性（146.04±9.02）显著增高（P<0.01）,但比CsA组（216.69±14.0）其ALP活性显著降低（P<0.01）;CsA组（216.69±14.0）较对照组（38.74±2.23）显著增高（P<0.01）。结论:（1）本实验采用磷酸二氢钠成功地建立了大鼠主动脉VSMCs钙化模型。（2）本试验发现大鼠主动脉钙化VSMCs中CaN mRNA、蛋白的表达以及活性明显增加的时候,PKG mRNA、蛋白的表达却出现明显减少,说明在钙化VSMCs中CaN对PKG具有抑制作用。（3）CsA可能促进细胞钙化。