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随着现代化工农业技术的日趋发展,水环境污染也渐趋严重。重金属污染是目前世界范围内面临的严峻问题之一,当排入水体的重金属含量超过其自净能力时,水体组成以及性质的变化将导致生物生长条件恶化,且重金属污染物难降解,可在动植物体内富集并对食用者造成巨大的危害。此外,水体环境中的贝类生物毒素经富集作用进入食品原材料后,也会对食品安全和人体健康造成巨大隐患。我国海洋环境主要污染地区集中在近海的局部海域,赤潮仍处于高发期,由此造成的赤潮藻类中的毒素累积在贝类中而形成贝类毒素,导致严重的食品安全问题。因此,快速准确、操作简便且可现场即时检测的水体毒素检测手段对保障食品安全和人类健康有重要的现实意义。本论文以水体环境中的化学毒素重金属汞离子(Hg2+)以及生物毒素石房蛤毒素(STX)为主要检测对象,以具有高度特异性的核酸适配体和抗体作为敏感元件,研制了三种用于现场快速检测的新型生物传感器,具体包括电化学DNA传感器、核酸试纸条传感器和酶联免疫比色传感器,结合便携式分析系统实现了对以上水体毒素的痕量检测与快速分析,具有便携、快速、灵敏度高及特异性好等显著特征,应用价值高。此外,还将研制的酶联免疫比色传感器拓展应用到癌症标志物的快速筛查上,以期实现对口腔鳞状细胞癌标志物细胞角蛋白19可溶性片段(Cyfra21-1)的快速检测。本论文的主要研究内容和创新性点如下:1、构建了一种基于金纳米带电极以及单链DNA的非标记型电化学传感器,实现了对水中Hg2+浓度的高灵敏检测本文构建了一种可用于检测水中痕量Hg2+的电化学DNA传感器,通过在金纳米带工作电极表面修饰富含胸腺嘧啶(T)的DNA单链来实现对Hg2+的特异性识别,而T-Hg2+-T错配结构的形成会促进电极表面电子传递,故可建立起电子转移阻抗与Hg2+浓度间的定量关系。实验优化了 DNA固定方式、时间以及与封闭剂的比例等系列条件,并利用金纳米带电极显著的非线性扩散以及极快的传质速率,提升了灵敏度和稳定性等检测性能,达到了 8 ng/L的检出限,同时拥有0.02-200 ng/L较宽的线性范围,通过与一般圆盘电极检测结果的比较,验证了纳米带电极检测性能的优越性。常规Hg2+检测方法,如冷原子吸收光谱法和等离子体电感耦合质谱法等,虽然检测灵敏度高,但需依赖大型仪器,操作复杂,检测周期长,价格昂贵,不适用于现场快速检测,而本文所构建的电化学DNA传感器简化了常规尺寸三电极体系所需的繁琐修饰过程,不标记电化学活性物质即可实现对Hg2+的高灵敏特异性捕获,更适合用于自动化检测以及现场应用。2、研制了一种基于DNA功能化AuNPs和竞争结合法的试纸条传感器,结合手持式光学检测仪及智能手机实现了对水中Hg2+的快速检测分析本文研制了一种现场检测痕量Hg2+的新型核酸试纸条,提出了竞争结合策略来提升检测灵敏度。目前Hg2+测定试纸条大多为半定量,少有做到超灵敏级别,而常用提高灵敏度的方法涉及到三条以上DNA链,不仅增加了复杂度,降低了稳定性和重复性,还大大提升了研制成本,并不适用于对Hg2+的现场大规模快速检测。本文则以富含T的单链DNA为探针来特异性识别Hg2+,将其作为预处理剂保证与样品的充分结合,同时减少了传统方法中由于在结合垫上单链自交形成的探针损耗,并以探针链的碱基互补链作为竞争链,将该竞争链修饰在示踪剂纳米金(AuNPs)上,形成的反向灵敏度有利于低浓度样品的分析。检测中采用了生物素-亲和素的结合体系来实现信号扩增,实验还优化了 DNA功能化AuNPs的制备、试纸条材料的预处理、结合垫和检测线上物质的包被浓度以及探针与Hg2+的孵育时间等条件,提升了检测性能。结合基于智能手机的手持式试纸条检测系统,实现了对水样中痕量Hg2+的快速检测,可在15 min内一步式检测溶液中的Hg2+浓度,检出限可达8ng/L。具有成本低、集成度高、操作简单和检测速度快等优势,检测人员只需滴定样品即可从智能手机端读取浓度数据,无需专业知识,非常适用于现场快速大规模检测。3、提出了一种基于AuNPs及生物素-亲和素的级联信号增强型酶联免疫方法,结合便携式多孔板检测仪及智能手机实现了 STX的快速高灵敏检测,此法同样适用于对口腔鳞状细胞癌标志物Cyfra21-1的快速筛查本文提出了一种利用AuNPs及生物素-亲和素对酶联免疫生化信号进行级联增强的方法,可同时适用于间接竞争法和双抗夹心法,结合基于智能手机的便携式光学检测系统,分别实现了对STX的现场快速高灵敏检测和对Cyfra21-1的快速筛查。将生物素化二抗修饰到AuNPs表面,利用AuNPs较大的比表面积实现第一级信号放大,再加入链霉亲和素和辣根过氧化物酶的结合物(SA-HRP),通过生物素-亲和素结合作用从而将HRP固定到AuNPs上,二抗上多个生物素结合位点使得信号得到进一步放大。实验证明该方案显著提高了传统酶联免疫法的检测灵敏度,对STX检出限可达0.4ng/mL,线性范围为1-200ng/mL,回收率为89.1-112.2%,变异系数(CV)4.6%-23.2%;对Cyfra21-1的检出限可达0.09 ng/mL,线性范围为0.25-8 ng/mL。所构建的生物传感系统具有方便、快速、易操作等特点,在大规模海产品的现场快速高灵敏检测中有巨大的应用价值,此外,通过进一步优化还有望在疾病快速筛查和早期诊断中拥有更好的应用前景。