论文部分内容阅读
克氏原螯虾（Procambarus clarkii）,俗称小龙虾、红螯虾等,其食性杂、生长快且适应力极强,自上世纪三十年代传入我国,因肉质鲜美而深受人们喜爱,之后快速占据淡水虾类经济产业的重要地位,现已成为世界上商品价值最大的虾类之一。十几年前南京的“龙虾门”事件,使人们对克氏原螯虾的病害情况开始有了重视,也吸引了越来越多的科研人士着手研究其染病、抗病等内容。另外,随着人们对克氏原螯虾的热情进一步高涨,供不应求的情况时有发生,这就迫使养殖户更大规模地进行养殖,随之而来的也是克氏原螯虾患病几率的增加及感染病原体的多样;而克氏原螯虾同其他无脊椎动物一样,仅依靠先天免疫来防御病原入侵,因此对克氏原螯虾先天免疫的研究更显得尤为重要。本课题研究了Caspase-3C、Lectin和LGBP三种重要的免疫基因在克氏原螯虾体内的免疫功能,并得到以下结果:1、在克氏原螯虾体内克隆到一种半胱氨酸蛋白酶基因,命名为PcCaspase-3C,该基因全长4684 bp,其包含一个1572 bp的开放阅读框（ORF）,编码523个氨基酸。该蛋白含有一个由237个氨基酸组成的CASc结构域和一个低复杂度区域。该基因主要表达于心脏、胃和肠道,在肝胰腺和鳃中表达量较低,在血细胞中表达最少。受金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌或白斑综合征病毒（WSSV）刺激后,PcCaspase-3C在肠、胃中的表达水平均有不同程度的上调。将该基因干扰后,再用副溶血弧菌刺激克氏原螯虾,发现有部分抗菌肽的表达被抑制,如ALF2、ALF5、ALF6、Cru4和Lys。将该基因敲低后,用WSSV感染克氏原螯虾,WSSV的拷贝数有明显增加。根据以上结果,推测PcCaspase-3C在克氏原螯虾抗细菌和抗病毒免疫应答中发挥重要作用。2、C型凝集素作为一类模式识别受体（PRRs）在甲壳动物的先天免疫中发挥重要作用。在本研究中,我们在克氏原螯虾中发现了一种新的凝集素基因（PcLectin）,该基因全长1025 bp,包括528 bp的ORF,编码175个氨基酸的蛋白。PcLectin蛋白含有一个信号肽和一个糖识别结构域（CRD）。该基因在胃中表达水平最高,在肝胰腺中表达较少,在其他组织中几乎不表达。在感染金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌或WSSV的虾中,PcLectin的表达均出现不同程度的上调。将该基因敲低后,用副溶血弧菌刺激克氏原螯虾,部分抗菌肽的表达被抑制（ALF2、ALF6、Cru2、Cru4）。将该基因进行体外原核重组表达,发现重组表达的蛋白对几种革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和多糖均具有结合活性,且能以Ca2+依赖的方式凝集细菌。综合以上结果,我们认为,PcLectin参与了克氏原螯虾先天免疫防御。3、脂多糖-β-1,3-葡聚糖结合蛋白（LGBP）作为一种模式识别受体,参与无脊椎动物先天免疫。本研究中,我们在克氏原螯虾体内克隆到一个LGBP基因,全长1327 bp,包括1113 bp的ORF,编码由370个氨基酸残基组成的蛋白质,其含一个信号肽、一个糖苷水解酶活性结构域（Glycohydro16）和一个低复杂度区域。经过研究,发现该基因在不同组织中的表达存在性别差异,在健康的克氏原螯虾体内,在雌虾各种组织中的表达量几乎都低于雄虾。无论是雌虾还是雄虾,都是在肝胰腺中表达最高,其他组织中表达较少,肠道中表达最少。经副溶血弧菌或脂多糖（LPS）刺激后,该基因在雌体和雄体中的变化情况亦有差异,但在胃和肝胰腺中的表达整体呈上升趋势。在雄虾的肝胰腺中,将PcLGBP基因敲低后,多种抗菌肽基因的表达都受到抑制。体外重组表达的LGBP蛋白（rPcLGBP）,对LPS、Glu和PGN都有不同程度的结合活性,并且可以结合多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。酚氧化酶活性测定实验结果表明,在正常雄虾的肝胰腺、鳃和胃中,其酚氧化酶活性均显著高于雌虾。在雄虾肝胰腺中,将PcLGBP敲低后,酚氧化酶活性降低。重组的LGBP蛋白和β-1,3-葡聚糖（Glu）或LPS孵育后可以明显提高肝胰腺的酚氧化酶活性。以上结果表明LGBP不仅可以参与抗菌肽基因的表达调控,还可以参与酚氧化酶的活化;在雄虾体内,其表达水平较高,赋予雄虾较高的酚氧化酶活性。