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慢性乙肝病毒(HBV)感染是严重危害人类健康的全球性感染疾病。在中国，乙肝病毒引起的肝脏疾病位列全国十大死因之一，严重影响了人们正常的工作和生活。目前，上市的抗乙肝病毒药物主要分为免疫调节剂（如干扰素α）和核苷类似物两大类。尽管这些药物在抑制病毒复制上都卓有成效，但是由于现有药物存在的低应答（干扰素）、耐药突变（核苷类似物）以及毒副作用等问题限制了它们在慢性乙肝治疗方面的应用。因此，靶向病毒聚合酶以外其他组分的新型抗乙肝病毒药物亟待开发。 本实验室在对大量化合物进行抗乙肝病毒活性筛选的基础上，发现W28系列的非核苷类小分子化合物对乙肝病毒复制表现出良好的抑制作用。经过不断的结构优化，我们最终确定抗病毒生物活性较强的化合物W28F为新药候选化合物，并开展了新药临床前研究，对其抗乙肝病毒活性和分子作用机制进行了深入的探讨。研究结果显示，在转染HBV的HepG2.2.15细胞模型上，W28F与该细胞共培养八天后，培养上清中HBV病毒颗粒和细胞质内病毒复制中间体的水平都呈现出药物浓度依赖性地减少，这一现象在Southernblot实验中也得到证实。此外，在鸭乙肝病毒感染的动物模型上，W28F也表现出优异的抗病毒疗效。 为了深入探讨W28F抑制乙肝病毒复制的具体机制，我们首先检测了病毒RNA水平的变化。在Northernblot检测中，我们提取了细胞总RNA，并通过HBV特异性探针检测相应的病毒RNA转录子。实验结果显示，W28F与细胞共培养后对病毒RNA的转录水平没有显著影响。同时，我们也用RT-PCR的方法间接检测了病毒RNA的丰度变化。研究结果显示，三种PCR产物水平都没有受到W28F的影响，说明W28F不是通过下调病毒RNA的转录水平来抑制乙肝病毒复制的。此外，我们用Westernblot和ELISA方法分别检测了核心蛋白的表达水平以及培养上清中s和e抗原的分泌情况。结果显示这三者都没有受到化合物W28F的影响，说明该化合物不作用于病毒蛋白表达和分泌过程。 基于病毒RNA和蛋白表达均未受到W28F的影响，病毒核壳体的组装状态成为我们关注的焦点。研究结果显示，随着化合物浓度的增加，病毒核壳体的聚合水平有了显著提高，但是核壳体内的病毒核酸水平却呈现下降趋势，与W28F抑制核壳体相关DNA的结果相一致。为了更清楚地验证这一现象，我们采用蔗糖密度梯度超速离心的方法将核壳体和核心蛋白分离。由于分子密度不同，通过蔗糖密度梯度离心，聚合的核壳体与未聚合的核心蛋白将分别处于不同的蔗糖密度层，从而达到分离的目的。实验结果显示，在高浓度W28F处理的细胞内聚合的核壳体数量明显增多，说明W28F确实促进了核壳体的形成。为了检验核壳体内DNA的减少是否归因于壳体化pgRNA的减少，我们通过RT-PCR检测核壳体内pgRNA的水平进行验证。实验研究发现，在W28F处理过的细胞内，PCR产物随着W28F作用浓度的升高呈浓度依赖性的减少，提示壳体化的pgRNA水平确实受到了化合物的影响。另一方面，在单独表达核心蛋白的瞬时转染细胞上，W28F促进核壳体组装的水平与在具有HBV复制能力的质粒转染的细胞上观察到的结果一致，说明W28F对核壳体组装的影响与pgRNA是否被包装无关。 近年来，HBV核心蛋白结构和核壳体组装过程的深入研究为抗HBV药物的研发提供了一条新的途径。由于病毒核壳体是其进行DNA复制的唯一场所，核心蛋白组装成为HBV生命周期中的限速步骤。为了研究W28F与核心蛋白的相互作用，我们在Escherichiacoli中表达了含有1-144个氨基酸的核心蛋白，通过体外表面等离子共振(SPR)实验检测W28F与核心蛋白的结合能力。研究发现，W28F在SPR反应单位(RU)上表现出浓度依赖性的增长，并呈现出快结合慢解离的典型结合曲线，并且通过拟合模型计算出的KD值与已知核壳体聚合抑制剂Bay38-7690的KD值相似。 综合目前所得的研究结果，我们推测，抗HBV新药候选化合物W28F抑制乙肝病毒复制的可能机制是:W28F与核心蛋白相互作用，错误介导了核壳体的组装形成过程;异常的核壳体形态导致壳体化的pgRNA数量减少，并且不能被表面蛋白包装和分泌出胞;另一方面，没有了pgRNA模板，病毒基因组也不能合成产生。因此，失去了基因组的空载核壳体丧失了复制能力，无法再进行下一轮感染。