论文部分内容阅读
超级细菌的出现严重影响和威胁了人类的健康甚至是生命。超级细菌实际上是一种耐药性细菌，抗生素药物对这类细菌基本不起作用。病人会因为感染这类细菌而引起可怕的炎症、高烧、痉挛、昏迷甚至死亡。细菌有多种形式的耐药机制，其中一种重要的机制是细菌的细胞膜上存在一类多药物转运蛋白，这类转运蛋白能够排斥药物分子，从而使细菌产生耐药性。因此研究这类蛋白及其药物转运机制具有重要的意义。 本文选择了大肠杆菌多药物转运蛋白MdfA作为研究靶标。MdfA蛋白属于Major Facilitator Superfamily，该家族蛋白是一类普遍存在于细菌和哺乳动物细胞中的次级转运蛋白，该家族蛋白主要利用细胞膜两侧的质子或钠离子跨膜电化学势作为驱动力对底物进行跨膜转运。MdfA蛋白主要利用质子跨膜电化学势转运多种药物分子，既包括电中性底物又包括带电荷底物，例如氯霉素，甲枫霉素，溴化乙锭，四苯鳞等。本文利用单分子荧光共振能量转移技术(smFRET)研究了MdfA蛋白在不同pH，不同底物条件下的动态构象。发现MdfA蛋白在apo状态下主要存在两种构象分别是内向开口和外向开口。不同的底物对蛋白的构象有不同的影响，电中性底物氯霉素和甲枫霉素将蛋白更倾向于稳定在内向开口构象，正电荷底物四苯鳞更倾向于将蛋白稳定在外向开口构象。不同底物对蛋白的动态性影响不同，四苯鳞可以加快蛋白两种构象的相互转变。此外，MdfA蛋白在高碱性环境下可以进行Na+/K+-H+反向转运，为了找到钾离子结合位点还研究了蛋白在不同盐浓度条件下的构象分布，发现K离子能够将蛋白锁定在一个内向开口。单分子实验为研究多药物转运蛋白的转运机制提供了新的实验证据。 此外，还利用单分子荧光共振能量转移技术研究了鼠源Giα蛋白的两个结构域（GTPase结构域和Helical结构域）在apo状态以及在不同底物条件下的构象转变，发现Giα蛋白在apo状态下至少存在三种状态，分别为:两个结构域之间完全开放状态、半关闭状态以及完全关闭的状态。且研究了Giα蛋白在不同GDP浓度梯度条件下三种FRET状态的分布，发现随着GDP浓度的增加，蛋白趋向于稳定在关闭的状态，此外还计算出蛋白在三种状态下对GDP有不同的解离常数。 最后通过细胞水平的荧光共振能量转移技术建立了拟南芥AtSWEET13蛋白的体内转运活性实验。通过体内转运活性实验，鉴定了AtSWEET家族区分单糖和二糖的的分子机制及关键氨基酸残基和负责胞内和胞外门控的关键氨基酸残基。此外还利用单分子技术研究了底物类似物dCMP和脂分子DPPG对蛋白构象的影响。