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透明质酸(HA)作为一种高分子粘多糖，由于其独特的分子结构和理化性质，已被广泛应用于医药、化妆品和食品行业中。采用微生物发酵法生产HA已经成为当前的主流工艺，相关研究受到学术界和产业界的普遍关注，其中HA的产量和分子量直接决定了产品的经济价值和使用范围，因此研究影响HA合成的因素及其作用机制一直是该领域的热点课题。对于高粘度的HA发酵过程，溶氧(DO)和搅拌一方面是确保菌体正常生长的必要条件，另一方面又是影响HA产量和分子量的主要因素。然而目前有关DO和搅拌对HA发酵过程影响的研究仍然非常有限，并且现有的认识还存在较大分歧。
本文以HA发酵过程为研究对象，从研究发酵过程动力学特征、流变学特性以及耗氧和传质特点入手，着重考察了通气搅拌生物反应器中DO和搅拌对菌体生长和HA合成的影响，并通过代谢通量分析(MFA)、关键酶和活性氧(ROS)的检测，以及计算流体力学(CFD)等手段，进一步研究了DO和搅拌强度对HA合成的影响机制，为设计和优化HA工业发酵过程、提高HA产量和分子量提供科学指导。
研究结果表明，菌体生长和HA合成相互偶联，但是HA合成存在0.52h的滞后。菌体在对数生长期的耗氧量(OUR)急剧增加，并在6h达到最大值(32.1mmolO2/L·h)，而此时发酵液的粘度仍然接近于水。随着HA的不断合成，发酵液粘度增大，并由牛顿流体逐渐转变为剪切稀化的非牛顿流体。进入稳定期以后，发酵液粘度达到最大(0.143Pa·s)，但此时氧气对菌体生长和HA合成影响已经很小。
通过考察DO和搅拌的影响发现，厌氧条件下菌体生长和HA合成均明显受到限制，而在有氧条件下HA的产量达到厌氧条件的5倍，但是DO水平对HA产量的影响很小。2～50％的DO范围内HA分子量随着DO水平的提高而增加，并在50％时达到最大值，为(2.19±0.05)×106Da，而当DO达到80％时，HA分子量又有所下降。通过分阶段控制DO水平发现，6～10h是菌体生长和HA合成的关键阶段。
虽然搅拌转速对最终的菌体量和HA产量没有显著影响，但是其对HA分子量的影响却较为明显。HA分子量在150rpm时仅为(1.69±0.03)×106Da，随着转速的提高，HA分子量在450rpm时达到了最大值，为(2.11±0.05)×106Da，而当转速增至1000rpm时，HA分子量下降了27％，并证实高转速既不会导致HA的过早脱落，也不会引起HA分子链的断裂。CFD模拟研究发现转速的提高使得混合时间明显减少，同时反应器内部的剪切速率显著增加，并且锚式桨产生的剪切速率要高于六斜叶45°涡轮桨。
通过MFA方法分析了DO水平对HA发酵代谢通量分布的影响，结果表明随着DO水平的提高，乳酸和乙酸的通量比由12:1(10％)降至2：1(80％)，而HA通量的变化并不显著。实验发现在有氧条件下has基因表达量和HAS酶活分别达到厌氧条件下的9倍和2倍，但DO水平对二者的影响并不明显。另外随着DO水平的提高，NADH氧化酶活性提高了40％，发酵6h的ROS水平(80％)也达到10％条件下的8倍。上述结果说明NADH氧化酶活性在DO和HA分子量之间发挥着重要的调控作用，一方面NADH氧化酶的活性随DO水平的提高逐渐增加，促进了ATP的产生，而ATP的生成有利于HA分子量的提高；另一方面，NADH氧化酶活性的增强可能引发了ROS的大量产生，对HA分子产生明显的降解作用。
最后，本文同样采用MFA方法比较了不同搅拌转速下的代谢通量分布，发现随着转速的提高，HA通量变化并不明显，但乙酸和ATP的通量显著增加，同时在1000rpm搅拌条件下发酵6h的ROS水平达到150rpm时的18倍，NADH氧化酶活性也提高了0.9倍。在此基础上通过添加水杨酸以降低ROS水平，以及去除锚式桨以降低桨叶区域的剪切速率，结果发现HA分子量可分别提高33.3％和23.9％。上述结果证明了搅拌强度对HA分子量的影响也与NADH氧化酶的活性有关，一方面转速的增加提高了NADH氧化酶的活性，促进了ATP的生成和营养物质的供给，有利于HA分子量的增加；另一方面，NADH氧化酶活性的提高可能导致了ROS的过量生成，进而造成HA分子量的降低。