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前言： 组织工程技术的发展为应对日渐增多的骨病、骨外伤和骨缺陷所带来的挑战提供了新的希望。天然骨是一种复杂和分层的有机矿化组织，由胶原纤维和均匀分布的羟基磷灰石(Hydroxyapatite HA)有机结合而成。高度有机的纳米纤维蛋白（主要是Ⅰ型胶原蛋白）不但为钙化组织提供不可或缺的三维支架结构，而且对HA颗粒有规律的立体化沉积有诱导作用。因此，在骨组织工程理论背景下，开发在化学上和结构上模仿天然骨的细胞外基质的纳米纤维结构的复合支架，具有广阔的前景。 羟基磷灰石(HA)是骨组织的主要无机成分，由于其具有良好的生物相容性、骨传导性以及便于装配的特性，已被用作替代骨组织的生物材料。HA，特别是纳米尺寸的HA（纳米HA），有更高的生物活性。不仅为骨传导、蛋白质黏附和骨再生提供了良好的微环境，也可作为生物种植应用的诱导剂和药物递送的载体系统。有报道用湿化学沉淀法、溶胶-凝胶合成法、共沉淀法、水热合成法、机械化学合成法、微波处理以及其他方法制备纳米HA。纳米HA颗粒的形状和尺寸的均一性对于以其组织工程产品和药物释放系统应用是至关重要的，也是纳米HA合成的关键。水分散性是在纳米HA生物应用中提出的。对此进行了许多实验，包括机械搅拌、超声波能量输入和柠檬酸根离子修饰。遗憾的是，这些方法要么只能为纳米HA提供暂时分散性，要么会损害其纳米结构和生物相容性。自然的生物矿化过程是最常用制备纳米HA的方法之一，其能提供满意的纳米结构和生物相容性。丝素蛋白(Silk Fibroin SF)，一个有β-折叠结构的线性多肽，具有调节生物矿化以及调节纳米HA成核和调节生长功能的天然蛋白。已知在不同条件下使用SF作为模板产生的纳米HA颗粒具有不同的形态，但如何以SF为模板制备尺寸均一的水分散性纳米HA迄今未见报道。正是由于在水溶液中，SF能自身聚集成不同尺寸和形状的微粒，从而给HA的矿化提供了非均质模板。丝素蛋白与HA结合形成的复合支架可以提高支架的生物医学特性。最常用的制造SF/HA复合材料方法是把HA粉末与丝素溶液混合。这会导致复合材料中HA颗粒分布不均匀、颗粒相分离和有限的HA颗粒浓度。 针对上述情况，本实验以丝素蛋白和钙磷溶液为原料，通过调节SF的自身聚集，获得均一的纳米SF模板，并以此模板调节HA生物矿化过程，得到大小均匀的水分散性纳米HA。最终构建成优化的SF/纳米HA复合材料，其在结构和组成上与天然骨组织相似。然后又采用形态学、qReal-time PCR以及酶检测等方法对该复合材料与骨髓间充质干细胞(BMSCs)融合的细胞相容性进行了检测，为探索一种可应用于骨组织工程，满足临床需求新型的骨修复材料奠定实验基础。 实验方法： 以氢氧化钙[Ca(OH)2]和磷酸(H3PO4)为原料，丝素蛋白作为调控纳米HA生长的模板，通过湿沉淀法合成不同SF/HA比例的SF/纳米HA复合材料。通过使用原子力显微镜(AFM)、纳米粒度系统动态光散射(DLS)技术、透射电镜(TEM)、X射线衍射(XRD)、傅立叶变换红外光谱仪(FTIR)、热重分析仪(TGA)和扫描电子显微镜(SEM)检测复合材料的微观形貌、化学结构和热稳定性等。 基于骨组织的结构特性，我们选择了不规则聚集的纳米HA颗粒(SF与HA的质量比为3∶7)和单分散纳米HA颗粒(SF与HA的质量比为8∶2)制备支架作为研究对象。采用体外细胞培养技术，将BMSCs接种在复合支架上进行共培养，用激光共聚焦扫描显微镜及SEM观察细胞在支架上的黏附及增殖情况。对碱性磷酸酶、钙离子含量进行测定，分析BMSCs分泌细胞外钙基质的能力。用(q)Real-timePCR、免疫组化染色等方法检测BMSCs成骨与骨化的能力。 实验结果： 通过AFM、纳米粒度系统动态光散射技术和TEM观察，结果显示，热处理后获得了均匀的SF纳米颗粒。SF颗粒的横向尺寸为20±0.9nm(N=300)，SF纳米颗粒的高度为5±0.5nm。不同浓度SF溶液配制的纳米HA颗粒的形态和水稳定性存在差异。随着SF浓度的增加，纳米HA颗粒的形态逐渐从针状变成米粒状，当SF/HA低于5∶5时观察到不规则的针状纳米颗粒聚集在一起，当SF/HA高于7∶3时观察到棒状的单分散性纳米HA颗粒（长约150-200nm，宽约65nm）。随着SF含量的增加，HA在水溶液中由沉积状态变为分散的状态。XRD、FTIR和TGA检测结果显示，没有其他磷酸钙相的HA晶体的存在，同时SF存在于纳米HA颗粒中。用TEM和SEM分别观察不同温度和不同pH处理的SF/纳米HA颗粒，结果进一步证实，SF存在于HA颗粒内部和表面，并且表面的SF在颗粒的水分散性中具有重要作用，同时pH值对纳米HA颗粒的水分散性也有重要的影响。 SEM观察支架内的颗粒微观结构和HA的分散度的结果显示，单分散纳米HA颗粒均匀地分布在复合支架中，支架孔壁的纳米纤维直径为20-100nm，其形态类似于天然细胞外基质中的纳米结构。共聚焦显微镜、SEM和DNA含量检测评估BMSCs与不同支架组织相容性结果显示，分散性好的与分散性差的SF/纳米HA支架内的BMSCs都增殖，但在有良好分散性的纳米HA颗粒的支架中细胞的增殖率要高于聚集的纳米HA颗粒支架。同时，较高含量纳米HA颗粒的支架具有较高的细胞相容性。碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase ALP)和钙含量的定量分析结果均显示具有:良好分散性和较高HA含量的支架组始终表现出增高的ALP水平和增多的钙沉积。Runx2、骨钙素(Osteocalcin OC)基因的表达以及Ⅰ型胶原蛋白免疫组织化学染色等结果显示，良好分散性的HA支架能显著诱导Runx2基因、OC基因和Ⅰ型胶原蛋白的表达。综上所述，SF/纳米HA多孔复合支架能促进BMSCs的黏附和增殖，促进成骨细胞分泌细胞外基质和增强组织工程骨钙化，其所构成的微环境有利于BMSCs的生长和向成骨细胞分化。 结论： 成功制备了新型组织工程SF/纳米HA颗粒支架材料，pH值9-10，SF/纳米HA8∶2时，材料的水分散性和稳定性最佳，孔隙率好。 SF/纳米HA颗粒支架材料与大鼠BMSCs融合良好，该支架材料促进干细胞的增殖生长和分化。